UPThèses

La commande motrice de l'appareil respiratoire requiert une coordination précise des muscles des voies aériennes supérieures (VAS) et de la pompe thoracique. Une modulation différentielle de ces deux groupes de muscles respiratoires est observée dans le sommeil normal ou les apnées obstructives. Nous avons exploré dans ce cadre de façon sélective les noyaux du raphe médullaire (RM) par stimulation électrique haute-fréquence (HFS) ainsi que le système sérotoninergique par modulation centrale des récepteurs 5-HT1A chez le rat anesthésié. La modulation différentielle des VAS a été reproduite par les agonistes et antagonistes 5-HT1A et par HFS des noyaux du raphe pallidal (RPa) et partie ventrale du raphe Obscurus. L'étude CFos a précisé les cibles cérébrales respiratoires. Nos données supportent l'hypothèse de l'implication du RM et du système sérotoninergique dans la modulation respiratoire différentielle des VAS lors des phases de transitions veille-sommeil. Dans ce travail nous avons examiné la fonctionnalité des cellules embryonnaires du mésencéphale ventral transplantées dans la substance noire dans un modèle animal de la maladie de Parkinson. Deux mois après transplantation, la mesure in-vivo de l'activité électrophysiologique par méthode extracellulaire des cellules transplantées montrait la présence d'une activité électrique identique à celle de neurones normaux de la SNc suggérant la maturation et fonctionnalité de type dopaminergique-like des neurones greffés. Les modulations par stimulations striatales anti et orthodromiques de ces neurones transplantés ont suggéré également la restitution de la fonctionnalité de la boucle nigrostriée.

La recherche de thérapies visant à empêcher la perte des cellules nerveuses ou bien leur remplacement est un enjeu crucial à l'heure actuel dans le domaine des neurosciences. Durant ma thèse, je me suis posé la question de savoir si le neuropeptide Y (NPY) pourrait avoir un intérêt thérapeutique dans des maladies neurodégénératives telles que les maladies de Parkinson et Huntington. Récemment, le NPY a montré de nouvelles propriétés comme celle de pouvoir stimuler la prolifération des cellules souches neurales ainsi que de protéger les neurones contre la toxicité de certaines drogues ou dans certaines conditions pathologiques. De plus, les variations de l'expression de ce peptide observées dans différentes conditions pathologiques tendent à penser que celui-ci pourrait agir tel un facteur favorisant des processus de réparation endogène au sein du cerveau adulte. Nous avons ainsi démontré que l'administration intracérébrale de NPY stimule la neurogenèse au sein de la zone sous-ventriculaire et du gyrus denté de l'hippocampe. Ayant observé la migration de cellules nouvellement générées sous l'influence du NPY vers le striatum ainsi que leur différentiation en neurones matures striataux, nous nous sommes par la suite intéressé au potentiel intérêt thérapeutique du NPY chez un modèle animal transgénique de la maladie de Huntington, maladie caractérisée par la perte massive de neurones striataux. De plus, considérant les variations de l'expression de NPY chez les patients atteints de la maladie de Huntington ou de Parkinson, nous avons recherché une éventuelle corrélation entre les concentrations plasmatiques de NPY et le stade d'avancement de la maladie...

Les lésions cérébrales induisent une mort neuronale associée à des déficits fonctionnels importants. Afin de pallier aux capacités limitées de régénération spontanée des neurones du système nerveux central adulte, nous avons évalué, dans un modèle de lésion par aspiration du cortex moteur chez la souris adulte, le potentiel de stratégies de remplacement cellulaire par la transplantation de neurones embryonnaires ou dérivés de cellules souches, et la mobilisation des cellules souches endogènes présentes dans la zone sous-ventriculaire (ZSV). L'efficacité des neurones greffés dépend de leur capacité à adopter un phénotype neuronal approprié et à établir des projections spécifiques vers l'hôte. Nous avons montré que les cellules embryonnaires transplantées immédiatement après la lésion dans le cortex moteur lésé se différencient en neurones matures corticaux et envoient des projections appropriées vers les cibles du cortex moteur. Nous avons montré qu'introduire un délai d'une semaine entre la lésion du cortex moteur et la transplantation augmente la vascularisation et la prolifération des cellules transplantées, ainsi que la densité des projections qu'elles développent. Par ailleurs, nous avons étudié la possibilité de générer des neurones corticaux à partir de cellules souches humaines comme source alternative de neurones à transplanter. Enfin, nous avons montré que la lésion du cortex moteur induit une augmentation de la prolifération cellulaire et de la neurogenèse dans la ZSV, et favorise la migration des neuroblastes de la ZSV vers le site de lésion.

Le cortex moteur primaire et le striatum permettent la planification et la sélection de mouvements. La dopamine régule l'activité des neurones dans ces deux structures. La perte des neurones à dopamine projetant de la substance noire compacte vers le striatum est à l'origine de troubles moteurs observés dans la maladie de Parkinson. Nous avons caractérisé le contrôle par la dopamine des neurones du cortex moteur primaire chez la souris et avons démontré que les fibres dopaminergiques innervent préférentiellement la représentation des membres antérieurs dans les couches corticales profondes. Nous avons montré que la dopamine module localement l’activité électrophysiologique des neurones cortico-striataux via les récepteurs D2. Ces résultats montrent que la dopamine peut exercer un contrôle direct sur la motricité au niveau des neurones du cortex moteur primaire. Nous avons par la suite déterminé le potentiel des thérapies cellulaires dans un modèle animal de la maladie de Parkinson. Les approches actuelles privilégient la greffe ectopique de neurones à dopamine dans la région cible, le striatum. Nous avons choisi une approche alternative consistant à pratiquer la greffe au niveau de la région lésée, la substance noire compacte. Nous avons montré chez la souris que la lésion des neurones dopaminergiques altère les propriétés électrophysiologiques des neurones du striatum et que la greffe homotopique de neurones entraîne une meilleure récupération de ces caractéristiques électrophysiologiques que la greffe ectopique dans le striatum. Ces résultats ouvrent des perspectives d'étude des effets de la greffe homotopique sur l'activité des autres structures contrôlant la motricité.

La maladie de Parkinson (MP) est une pathologie neurodégénérative associée principalement à une perte progressive de neurones dopaminergiques de la substance noire (SN) conduisant à une diminution de dopamine au niveau du striatum. Une des approches thérapeutiques expérimentales de la MP est la greffe de neurones dopaminergiques, non pas au niveau de la SN, mais directement dans la région cible, le striatum, et ceux avec des résultats variables. Dans cette étude, nous avons comparé en détail la récupération fonctionnelle suite à la transplantation de mésencéphale ventral (MV) fœtal provenant de souris exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur de la tyrosine hydroxylase soit au niveau de la SN soit dans le striatum de souris adultes lésées unilatéralement à la 6-hydroxydopamine. Les conséquences anatomiques et fonctionnelles ont été analysées par des approches comportementales, électrophysiologiques et immunohistochimiques. Nos résultats montrent que les neurones greffés dans les deux emplacements envoient des projections vers le striatum. De plus, les deux types de greffes induisent une amélioration significative de la motricité ainsi que de l'activité des neurones du striatum. Toutefois, seule la greffe intranigrale a permis la restauration de la motricité fine des membres antérieurs et un retour à une excitabilité des neurones striataux à l’état basal.

Les lésions du système nerveux central (SNC) entraînent une perte neuronale associée à des déficits fonctionnels importants. En réponse à une lésion, les capacités de repousse axonale et de régénération spontanée des neurones du SNC sont limitées. Nous avons évalué, dans un modèle de lésion corticale chez la souris adulte, le potentiel des greffes de neurones corticaux embryonnaires à réparer les voies corticales lésées. L'efficacité de cette approche thérapeutique dépend (1) du degré de survie des cellules greffées, (2) de la capacité des cellules greffées à se différencier en type neuronal approprié et (3) de la capacité des neurones greffés à restaurer les voies corticales endommagées de façon spécifiques. Nous avons montré que les neurones embryonnaires corticaux d'origine du cortex moteur transplantés immédiatement après la lésion du cortex moteur adulte se différencient en neurones matures exprimant les mêmes neurotransmetteurs et marqueurs de couches corticales que ceux du cortex normal. De plus, les neurones transplantés développent des projections vers les cibles corticales et sous corticales appropriées. Par ailleurs, nous avons étudié l'influence de la neuroinflammation post-lésionnelle sur la survie des neurones transplantés et, l'influence des neurones transplantés sur la neuroinflammation de l'hôte.

Première cause de baisse d'acuité visuelle dans les pays industrialisés, la dégénérescence maculaire liée l'âge (DMLA) est une pathologie de la rétine touchant principalement les personnes après 55 ans. Elle est caractérisée par une dégénérescence de la zone maculaire de la rétine et par la formation de drusens. Il existe deux formes de la maladie : la forme exsudative et la forme atrophique. Dans notre étude, nous nous sommes focalisés sur la DMLA atrophique, actuellement sans traitement curatif et qui correspond à environ 50% des cas cliniques en Europe. Malgré de nombreuses recherches, les causes de la DMLA restent encore mal comprises même si des facteurs environnementaux (sénescence, accumulation de lipofuscine, stress oxydatif) et génétiques sont probablement combinés. Selon l'hypothèse étiopathogénique, le dysfonctionnement des cellules de l'épithélium pigmenté de la rétine (EPR) est au centre des événements physiopathologiques de la DMLA. A partir de sujets sains et de patients atteints de la DMLA atrophique, nous avons obtenu des cellules de l'EPR dérivées de cellules souches pluripotentes induites et développé un modèle cellulaire humain utile pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la DMLA. Ainsi, l'étude morphologique et fonctionnelle de ces deux populations de cellules a souligné un phénotype particulier des cellules de l'EPR provenant de patients atteints pas la DMLA en condition basale et en milieu pro-oxydant. Ce modèle cellulaire pourra nous permettre d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes amenant au développement de la DMLA et pourra aussi être utilisé pour le screening des molécules au cours des étapes précliniques.

La maladie de Parkinson (MP) est caractérisée essentiellement par la perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire parse compacte (SNpc) qui innervent le striatum et contrôlent les mouvements volontaires. Une des approches thérapeutiques de la MP est la transplantation ectopique de précurseurs DA fœtaux issus du mésencéphale ventral (MV) dans le striatum. Il est peu probable que la transplantation des neurones DA du MV humain devienne un traitement de routine de la MP en raison de problèmes d’approvisionnement et de standardisation de tissus pour la transplantation. L’avenir de ces greffes dépend donc de l’obtention de sources alternatives de tissus. L’objectif de ce projet est d’obtenir des neurones DA issus de cellules souches embryonnaires de souris et d’évaluer leur potentiel thérapeutique en les greffant dans le striatum ou la SN dans un modèle murin de la MP. Afin d’augmenter le nombre de neurones DA du type nigral, l’expression de LMX1A, un facteur de transcription jouant un rôle clé dans le développement embryonnaire des progéniteurs des neurones DA du MV, a été forcée. Nous avons montré que, in vitro, LMX1A induit une augmentation de précurseurs et de neurones DA du type nigral. Après transplantation dans la SN ou le striatum, les cellules survivent, expriment des marqueurs de neurones DA du type nigral et projettent vers le striatum. L’expression forcée de LMX1A semble augmenter, in vivo, la proportion de neurones DA matures responsables d’une réduction des déficits moteurs après transplantation dans le striatum.

La maladie de Parkinson (MP) est caractérisée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNc) et par l'accumulation anormale d'alpha-synucléine (α-syn) agrégée. Cette dégénérescence entraîne la perte d'innervation dopaminergique au niveau du striatum dorsal, principale région de projection de la SNc, et aboutit au développement de troubles moteurs (akinésie, bradykinésie, tremblement de repos, posture anormale). La transplantation intrastriatale de neurones dopaminergiques issus du mésencéphale ventral foetal (MVF) chez des patients atteints de la MP a démontré le potentiel thérapeutique de cette technique. Cependant, 10 à 24 ans après la transplantation de neurones foetaux dans le striatum de patients parkinsoniens, plusieurs études ont mis en évidence la présence d'agrégats d'α-syn dans le greffon. La présence de ces agrégats semble être le résultat de la propagation de l'α-syn du cerveau de l'hôte vers les neurones greffés selon un mode de propagation de type prion. Le striatum n'étant pas le site endogène des neurones dopaminergiques nigraux, nous avons émis l'hypothèse qu'il représenterait un environnement défavorable au développement des neurones transplantés, les rendant ainsi plus vulnérable aux processus pathologiques. Mon projet de thèse avait donc pour objectif d'étudier la propagation de l'α-syn du cerveau de l'hôte vers les neurones greffés en comparant deux sites de transplantation, la SNc ou le striatum. Dans un premier temps, nous avons développé et caractérisé deux modèles murins de la MP obtenus par l'injection unilatérale d'un vecteur viral adénoassocié permettant l'expression d'α-syn humaine mutée A53T (AAV2/9-hα-synucléine A53T) dans la SNc ou le striatum de souris C57BL6. Nous avons ainsi mis en évidence que 5 semaines après l'injection du vecteur viral, les souris présentent une altération de la motricité associée au développement d'une lésion dopaminergique et d'une synucléinopathie dans la SNc et le striatum des animaux injectés. Dans un second temps, nous avons utilisé ces modèles animaux de la MP pour comparer la propagation de l'α-syn du cerveau de l'hôte vers les neurones greffés selon le site de transplantation. Pour cela, des progéniteurs dopaminergiques issus du MVf murin ont été transplantés dans la SNc ou le striatum d'animaux préalablement injectés avec le vecteur viral en position respectivement nigrale et striatale. La propagation de l'α-syn humaine a été évaluée dans les neurones greffés à 2, 5 et 8 mois après la transplantation. Dès 2 mois après la transplantation, nous avons mis en évidence l'accumulation d'α-syn humaine dans les greffons nigraux et striataux. A 2 et 8 mois après la transplantation, les greffons striataux contiennent environ 20% d'α-syn humaine de plus que les greffons nigraux. Des résultats similaires ont été obtenus avec la forme phosphorylée de l'α-syn, caractéristique des agrégats pathologiques dans la MP. Ces résultats soutiennent l'hypothèse selon laquelle le striatum représente un environnement défavorable pour les cellules greffées, les rendant plus vulnérables à l'accumulation pathologique d'α-syn.