UPThèses

La résistance aux antibiotiques est devenue un problème de santé publique majeur faisant l’objet de mesures au niveau national et européen. La logique économique n’incitant pas les grands groupes pharmaceutiques à investir dans la recherche en infectiologie, les résistances apparaissent plus vite que les nouveaux antibiotiques, créant des situations d’impasses thérapeutiques. Ainsi, dans ce contexte de pénurie, des antibiotiques plus anciens comme les polymyxines, souvent délaissés à cause de leur toxicité, constituent parfois le traitement de dernier recours. La polymyxine B est l’un des principaux antibiotiques utilisés pour lutter contre les infections pulmonaires causées par les souches multirésistantes d’Acinetobacter baumannii, rencontrées chez les patients de réanimation. Cependant, plusieurs paramètres peuvent influencer l’efficacité des antibiotiques, comme par exemple la densité bactérienne au site infectieux qui varie au cours du temps : en cas de traitement et/ou de réponse immunitaire efficaces la densité bactérienne diminue, dans le cas contraire, elle augmente. Or, une forte densité bactérienne est souvent associée à une diminution de l’efficacité des antibiotiques : ce phénomène microbiologique est appelé l’effet inoculum. Ainsi dans ce travail, l’impact de la taille de l’inoculum d’A. baumannii sur la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de la polymyxine B a été évalué à travers deux études principales : 1. L’étude pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) in vitro de la polymyxine B contre une souche clinique d’A. baumannii sensible à la polymyxine B. Pour cela, des courbes de bactéricidie sur 30h en présence de polymyxine B (0,125 à 128 mg/L) et de quatre inocula croissants d’A. baumannii (105 à 108 UFC/mL) ont été réalisées. Ces données expérimentales ont montré un effet inoculum marqué notamment après analyse des résultats par des approches PK/PD semi-mécanistiques. En effet, l’effet inoculum a été caractérisé dans le modèle par une augmentation de la concentration permettant l’obtention de 50% de l’effet maximal (EC50) de la polymyxine B par un facteur 17 en présence du plus fort inoculum, comparativement au plus faible. Afin de comprendre les mécanismes d’adaptation à la polymyxine B mis en place par A. baumannii, un séquençage du génome entier et une évaluation de l’expression des principaux gènes de résistance décrits chez ce germe ont été réalisés. Ces expérimentations ont montré que la résistance adaptative observée n’était pas due à la mise en place de ces mécanismes. 2. L’étude PK/PD in vivo de la polymyxine B dans deux modèles de référence d’infection à A. baumannii. Dans premier temps, les modèles murins neutropéniques d’infection de la cuisse et d’infection pulmonaire ont été mis au point. Puis, l’efficacité in vivo sur 24h de la polymyxine B administrée par voie sous-cutanée a été étudiée. Ces deux modèles ont montré que l’efficacité de la polymyxine était supérieure dans le modèle d’infection de la cuisse que dans le modèle d’infection pulmonaire. De plus, une étude d’effet inoculum d’A. baumannii (106 et 107 UFC/cuisse) en présence de polymyxine B a été réalisée in vivo chez la souris présentant une infection de la cuisse. Cette étude PD a ensuite été couplée à une étude PK qui a été réalisée à 3 doses (1, 15 et 40 mg/kg) afin de déterminer les paramètres PK de la polymyxine B. Ces données PK/PD in vivo ont été initialement analysées avec le modèle PK/PD semi-mécanistique développé à partir des données in vitro. Le modèle in vitro ne permettant pas de décrire correctement les données in vivo, un nouveau modèle a été développé à partir des données in vivo. Les résultats préliminaires montrent que l’effet inoculum d’A. baumannii sur l’efficacité de la polymyxine B est moins important in vivo. Des expérimentations supplémentaires avec un troisième inoculum sont à prévoir afin de mieux caractériser cet effet inoculum in vivo.

Du fait du manque de nouveaux antibiotiques et de l’augmentation des résistances, il est important de comprendre les mécanismes et la dynamique de ces phénomènes. La modification du lipopolysaccharide (LPS) est le principal mécanisme contribuant à la résistance des bactéries aux polymyxines. Le plasmide portant le gène MCR-1 (Mobile Colistin Resistance) retrouvé chez Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae code une phosphoethanolamine transférase capable de modifier le LPS par une addition de phosphoethanolamine sur le lipide A du LPS alors que chez Acinetobacter baumannii résistant aux polymyxines il a été décrit à la fois des modifications du LPS par une phosphoethanolamine et une perte du LPS. Cependant, les interactions entre les différents mécanismes exprimés par ces bactéries à Gram-négatif pour devenir résistantes à la colistine et à la polymyxine B sont encore peu décrit. Les courbes de bactéricidies séquentielles ont étés utilisées comme une approche alternative pour discriminer l’héterorésistance de la population bactérienne (2 sous populations S/R) d’une résistance adaptative (AR) durant le traitement par la colistine ou la polymyxine B. Au cours de ce travail de thèse, nous avons: 1. Confirmé que l’approche des courbes de bactéricidies séquentielles peut discriminer deux modèles pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) semi-mécanistiques décrivant soit une population stable héterorésitante (S/R) soit une population bactérienne instable et homogène dont la résistance s’adapte au cours du temps (AR). 2. Déterminé l’impact de la présence du plasmide MCR-1 sur les mécanismes de résistance chromosomique impliqués dans la résistance adaptative de E. coli and K. pneumoniae aux polymyxines. 3. Déterminé les mécanismes impliqués dans la résistance aux polymyxines dans deux souches cliniques d’A. baumannii, isolées avant et après traitement d’un patient à la colistine. Dans ce travail, une nouvelle approche de courbes de bactéricidies séquentielles a été utilisée et validée afin de pouvoir différencier différents modèles PK/PD semi-mécanistiques. De plus, ce travail a montré que la présence du plasmide MCR-1 favorisait l’activation d’autres mécanismes chromosomiques conduisant à de hauts niveaux de résistances aux polymyxines. Enfin, la polymyxine B montrait une plus faible capacité à induire ces mécanismes chromosomiques conduisant à de hauts niveaux de résistance.

Pseudomonas aeruginosa (PA) et Acinetobacter baumannii (AB) sont responsables d'infections pulmonaires chroniques souvent associées à la formation de biofilms, i.e. des agrégats bactériens piégés dans une matrice riche en polymères anioniques tels que l'alginate ou l’ADN. Au sein de ces biofilms, la diffusion des antibiotiques cationiques (ATB), tels que la tobramycine (TOB) et la colistine (COL), est en partie réduite due aux interactions avec les polymères de la matrice. Les principaux objectifs de cette thèse ont été dans un premier temps de développer un modèle de biofilm pulmonaire mimant ceux retrouvés dans les infections pulmonaires chroniques des patients atteints de mucoviscidose (CF), l'une des principales maladies pulmonaires dans laquelle ces biofilms se développent. Un nouveau système d’administration d'ATB, composé de nanoparticules lipidiques chargées de COL, a été par la suite développé et testé grâce à ce modèle de biofilms pulmonaires. Chez les patients atteints de CF, PA forme des biofilms constitués d'agrégats (50-100 μm) incorporés dans leur mucus pulmonaire. Un modèle de biofilm pulmonaire in vitro composé des polymères présents in vivo (alginate, mucines, ADN) et constitué de PA piégés dans des billes d'alginate, a été développé et évalué à l'aide de la COL et de la TOB. Ce modèle a été optimisé en évaluant l'effet de la taille des billes et du milieu de croissance dans lequel elles ont été dispersées. La modification de la taille des billes de 60 à 1200 µm et l'utilisation d'un milieu de dispersion simulant la composition du mucus pulmonaire ont permis de réduire davantage l'efficacité de la TOB dans ce modèle. Pour des concentrations élevées en TOB, des variants de PA formant de très petite colonies (SCV), également trouvés chez les patients atteints de CF, ont été observés dans le modèle, ce qui suggère une bonne imitation des conditions in vivo. Dans ce modèle, l'efficacité de la COL a été moins affectée que celle de la TOB, et aucune SCV a été observé. Des nanoparticules lipidiques PEGylées chargées de COL et contenant un adjuvant lipophile à la COL tel que le farnésol ont été développées pour augmenter son efficacité contre les biofilms. L'encapsulation de la COL a amélioré son efficacité par un facteur deux dans le modèle de biofilm pulmonaire à PA précédemment développée. Ces nanoparticules ont permis également de restaurer la sensibilité à la COL d'une souche résistant d’AB et ont amélioré son efficacité dans un modèle de biofilm d’AB formé sur une surface abiotique.

Les parabènes, reconnus comme perturbateurs endocriniens, sont couramment utilisés en tant que conservateurs dans l’alimentation et les cosmétiques mais également dans les médicaments. Selon l’hypothèse de la DOHAD (Developmental Origins of Health And Diseases), l’exposition pré- et périnatale à ces composés est un facteur de risque de développer des maladies chroniques plus tard dans la vie. Les nouveau-nés, et plus particulièrement les prématurés, constituent une population particulièrement vulnérable à ces substances du fait de l’immaturité de leur métabolisme et de la poursuite du développement à cette période de vie, notamment concernant leur système endocrinien. Néanmoins, l’exposition des nouveau-nés aux parabènes n’a été que très peu étudiée, en particulier l’exposition à travers l’administration des médicaments. L’objectif de cette thèse est d’étudier l’exposition des nouveau-nés aux parabènes via l’administration des médicaments. Pour cela, nos travaux ont consisté à : (i) Identifier les médicaments utilisés en pédiatrie contenant des parabènes et estimer l’exposition aux parabènes à l’aide d’une cohorte de plus de 8000 nouveau-nés hospitalisés dans les établissements de santé français ; (ii) Mettre au point une méthode de dosage sanguin ultrasensible des parabènes, adaptée à cette population afin d’évaluer la part attribuable aux médicaments dans l’exposition aux parabènes ; et (iii) Proposer des stratégies alternatives permettant de limiter cette exposition dans la prise en charge de ces nouveau-nés. Nos résultats montrent une exposition significative des nouveau-nés, qu’ils soient prématurés ou nés à terme, à trois parabènes. Plus de 50% des nouveau-nés ont été exposés au moins une fois au méthyle et au propylparabène, cette fréquence d’exposition diminue avec l’âge gestationnel à la naissance. Cette tendance a été également retrouvé également pour l’éthylparabène. Les valeurs moyennes d’exposition étaient de 0,654 ± 0,892, 0,256 ± 0,261 et 0,097 ± 0,136 mg/kg/j pour le méthyle, l’éthyle et le propylparabène respectivement. Cette exposition est retrouvée dans tous les établissements de santé étudiés et des différences significatives ont été observés en fonction de l’âge gestationnel à la naissance. Les nouveau-nés à terme et les très grands prématurés (<28 semaines d’aménorrhée) sont particulièrement exposés au méthyle et au propylparabène, tandis que l’exposition à l’éthylparabène concerne essentiellement les nouveau-nés à terme. Trente médicaments ont été impliqués dans l’exposition des nouveau-nés aux parabènes, avec des différences d’utilisation entre les centres. Nos recherches ont montré que certains d’entre eux peuvent être substitué, soulignant la nécessité de prise en compte de ces éléments dans le référencement des médicaments. Pour d’autres, des changements de pratiques et une modification des formules galéniques par les industriels est nécessaire pour limiter l’exposition de ces enfants. Concernant les possibilités de substitution, nous avons développé et évalué la stabilité de préparations hospitalières sans parabènes sur une durée de 60 jours, afin de proposer une alternative sans parabènes pour des molécules n’existant pas avec une forme galénique adapté chez le nouveau-né. Enfin, la méthode de dosage ultrasensible mise au point a été validée selon les critères internationaux, permettant de doser les parabènes de façon fiable sur un faible volume d’échantillon (50 µL). Son applicabilité a été démontrée sur des échantillons plasmatiques issus de nouveau-nés. Au final, ces travaux apportent un éclairage complet sur l’exposition des nouveau-nés aux parabènes en démontrant que les médicaments sont une source non-négligeable d’exposition. Nous apportons également des solutions alternatives dont la mise en œuvre permettra de diminuer cette exposition durant l’hospitalisation des nouveau-nés.

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie non-tuberculeuse responsable d’infections pulmonaires difficiles à traiter en clinique. Le traitement actuellement recommandé est associé à un taux d’échec élevé et à l'émergence de résistances à la plupart des antibiotiques. Dans le contexte actuel, avec un faible nombre de nouveaux antibiotiques mis sur le marché, il est important de d’optimiser l’utilisation des antibiotiques à notre disposition par des approches pharmacocinétique/pharmacodynamiques (PK/PD). Dans les infections pulmonaires, l'administration directe de médicaments à faible perméabilité tels que la céfoxitine (FOX) et l'amikacine (AMK) dans les poumons sous forme d'aérosols devrait accroître leur efficacité au site d’infection tout en diminuant la toxicité systémique responsable des effets indésirables, particulièrement dans le cas des traitements prolongés. De plus, l'utilisation d'antibiotiques en combinaison pourrait réduire le risque de développement de résistance. Plusieurs points ont été abordés dans cette thèse : 1. Études biopharmaceutiques sur AMK et FOX : Il a été démontré qu'après la nébulisation d'AMK et de FOX, les concentrations pulmonaires étaient presque 1000 fois plus élevées qu'après l'administration intraveineuse des deux antibiotiques, ce qui en fait de bons candidats pour la nébulisation. 2. Étude PK/PD de céfoxitine : un modèle PK/PD semi-mécanique a été mis au point à partir de données pharmacocinétiques in vitro, permettant d'identifier les relations concentration-effet pour deux sous-populations de bactéries tout en tenant compte de la dégradation de la céfoxitine. 3. Étude pharmacocinétique et pharmacodynamique de la bi-combinaison : à l'aide d'un modèle mathématique basé sur un mécanisme et de données obtenues à partir données in vitro, il a été démontré que l'effet combiné d'AMK et de FOX était additif et/ou synergique selon les différentes concentrations. 4. Bi- ou tri-combinaisons : plusieurs tri-combinaisons incluant AMK, FOX et un 3ème antibiotique (incluant clarithromycine, linézolide, clofazimine, ciprofloxacine, moxifloxacine, rifampicine et rifabutine) ont été testés contre une souche de référence, un isolat clinique résistant à la clarithromycine (Ma1611) et un isolat clinique multirésistant (T28). Toutes les tri-combinaisons étaient actives contre la souche de référence. Les combinaisons étaient également actives sur la souche Ma1611 sauf pour les associations avec la clofazimine et la clarithromycine. Aucune combinaison n'était active contre T28. Les bi-combinaisons avec de plus fortes concentrations de FOX et les fluoroquinolones ou les rifamycines étaient efficaces contre T28. Cela suggère une optimisation du schéma thérapeutique pour le traitement des infections pulmonaires à M. abscessus. 5. La tri-combinaison comprenant AMK, FOX et moxifloxacine (MXF) jusqu'à 21 jours contre un isolat clinique résistant à la clarithromycine Ma1611 n'a montré aucun effet supplémentaire de l'utilisation de MXF car la tri-combinaison n'était pas plus efficace que la bi-combinaison d'AMK et FOX.

Face à la pénurie de nouveaux anti-infectieux et à l’émergence toujours plus importante d’agents infectieux multi-résistants, il est primordial de mieux utiliser l’arsenal thérapeutique à notre disposition. Cela peut passer par l’utilisation de nouvelles voies d’administration afin d’agir plus efficacement localement. Pour traiter des infections pulmonaires, l’inhalation ou la nébulisation apparaissent comme des voies logiquement intéressantes. Il a été montré précédemment que les molécules plutôt hydrophiles étaient des bonnes candidates à cette voie d’administration car l’épithélium pulmonaire leur était peu perméable et que le principe actif était séquestré au niveau du poumon. A l’inverse, pour les composés lipophiles qui diffusent rapidement à travers l’épithélium, l’administration pulmonaire ne présente que peu d’intérêt thérapeutique. La situation se complexifie dans le cas de la nébulisation de promédicaments et/ou lorsque des pompes d’efflux interviennent dans la distribution pulmonaire des anti-infectieux. Afin de mieux caractériser le rôle des pompes d’efflux dans la distribution pulmonaire des anti-infectieux in vitro et leur impact in vivo, la distribution pulmonaire de plusieurs anti-infectieux a été évaluée selon un protocole standardisé chez le rat, permettant de mesurer et donc de comparer les concentrations libres plasmatiques et dans le liquide épithélial pulmonaire (ELF) après administrations systémique et intratrachéale. Le premier travail porte sur la distribution pulmonaire de l’oseltamivir, un anti-viral actif contre la grippe, qui est administré sous forme de promédicament (oseltamivir phosphate (OP)). Il a été montré in vitro que l’OP (non actif) est substrat de pompes d’efflux et que ce transport actif se caractérise in vivo par des concentrations locales plus élevées d’OP dans l’ELF que dans le plasma quelle que soit la voie d’administration (intraveineuse ou nébulisation). Cependant, ces fortes concentrations pulmonaires en promédicament n’ont que peu d’effet sur les concentrations pulmonaires en molécule active (oseltamivir carboxylate (OC)), du fait d’une faible conversion locale en composé actif et de la perméabilité pulmonaire de l’OC. La deuxième étude présente le cas des oxazolidinones (linézolide et tédizolide) utilisées pour traiter les infections à Gram positif pour lesquels des études in vivo préalablement réalisées chez l’homme avaient montrées des concentrations locales (ELF) supérieures aux concentrations plasmatiques après administration orale. Ces données ont été retrouvées chez le rat selon notre protocole standardisé et complétées avec des données après nébulisation, suggérant un rôle majeur des transporteurs dans ladiffusion pulmonaire notamment du tedizolide. Cependant, les études de perméabilité membranaire et d’inhibition in vitro réalisées sur un modèle cellulaire (NCI-H441) n’ont pas pu mettre en évidence le rôle de ces transporteurs d’efflux sur les concentrations pulmonaires élevées. D’autres explications ont été envisagées comme la liaison à des protéines dans l’ELF ou encore la pénétration intracellulaire des principes actifs. En conclusion, ces études in vivo et in vitro sur 4 composés nous ont permis d’améliorer nos connaissances sur les paramètres qui gouvernent la diffusion pulmonaire des anti-infectieux telles que la perméabilité et l’affinité pour des transporteurs d’efflux et de montrer la complexité d’extrapolation in vitro/in vivo.

La colistine est un antibiotique utilisé en dernier recours dans les infections à bacilles gram négatifs multirésistants. Elle est administrée sous la forme de sa prodrogue, le colistiméthate sodique (CMS). Bien que les données disponibles sur cet antibiotique aient largement augmenté depuis l’apparition des dosages du CMS et de la colistine par méthode séparative couplée à un détecteur, les disparités entre les études perdurent, les mécanismes pharmacocinétiques impliqués ne sont pas tous élucidés et les données manquent quant à l’optimisation de l’utilisation de cet antibiotique. Cette thèse a permis de : 1- Vérifier que les dosages de CMS et colistine réalisés dans différents centres européens étaient conformes et homogènes via la réalisation d’une étude de cross-validation multicentrique. 2- Mettre en évidence l’ampleur de la variabilité interindividuelle des concentrations moyennes à l’équilibre en colistine et montrer que cette variabilité était essentiellement due à la clairance de la colistine. 3- Montrer les difficultés de la mise en place d’une optimisation posologique précoce du CMS par analyse bayésienne. 4- Evaluer l’impact pharmacocinétique d’une administration du CMS en une seule injection journalière. 5- Etudier la pharmacocinétique du CMS et de la colistine après administration par voie intraveineuse et nébulisée de CMS chez les patients souffrant de mucoviscidose. 6- Suggérer une augmentation de la posologie de la colistine en pédiatrie. Ces travaux ont permis d’accroître les connaissances sur la pharmacocinétique de la colistine et de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients.

De nombreuses affections chez l’enfant et l’adulte sont associées à une exposition in utero à des perturbateurs endocriniens (PE). Pour réduire cette exposition, des programmes d’éducation pour la santé environnementale périnatale se développent. Ils font évoluer des dimensions psychosociales que sont la perception du risque (PR) et la croyance en l’action de réduction de l’exposition (CAR), mais peu d’entre eux sont évalués L’étude de recherche interventionnelle PREVED a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un programme d’éducation pour la santé environnementale pour des femmes enceintes, visant à diminuer leur exposition aux PE. Les objectifs de ces travaux métrologiques étaient de développer des outils (i) analytiques et (ii) épidémiologiques en vue d’évaluer l’efficacité du programme. Ainsi, (i) des méthodes analytiques ultrasensibles par LC-MS/MS permettant de doser les fractions non conjuguées de PE dans les urines et le colostrum ont été développées et validés sur des prélèvements recueillis dans le cadre de la cohorte périnatale EDDS; (ii) un questionnaire psychosocial explorant la PR, la CAR et les connaissances des femmes enceintes au moyen de scores a été conçu. Ces travaux s’inscrivent dans une approche interdisciplinaire de santé environnementale. Ils proposent des méthodes analytiques fiables pour mesurer l’exposition aux PE étudiés d’une part, et un questionnaire évaluant connaissances, attitudes et pratiques des femmes enceintes sur la question des PE d’autre part. Ces outils permettront de mesurer l’impact du programme d’éducation pour la santé environnementale périnatale.

Le bisphénol A (BPA), ubiquitaire dans l'environnement, est reconnu comme étant un perturbateur endocrinien (PE). La forte réactivité du BPA avec le chlore entraine la formation de dérivés chlorés du BPA (ClxBPA), possédant une activité perturbatrice endocrinienne supérieure au BPA. En santé environnementale, l'évaluation du risque chez l'homme implique notamment la mise en place d'études de biomonitoring et de toxicocinétique nécessitant l'analyse des micropolluants environnementaux dans les milieux biologiques. Afin d'estimer l'exposition des populations au BPA et ClxBPA, une méthode d'analyse par LC-MS/MS du BPA et des ClxBPA non conjugués a été validée dans l'urine. Cette méthode a ensuite été modifiée afin d'améliorer la rapidité et la sensibilité du dosage, et a été appliquée à la mesure de l'exposition aux PE dans une cohorte de femmes enceintes. L'étude de la toxicocinétique du BPA montre la formation de dérivés conjugués, éliminés par voie urinaire. Classiquement, pour la mesure des dérivés conjugués, des méthodes indirectes utilisant la déconjugaison enzymatique sont proposées. Dans ce cadre, nous avons développé une méthode originale permettant de valider l'efficacité de la déconjugaison. Si la mesure indirecte des métabolites après déconjugaison semble plus aisée, il reste néanmoins plus rationnel de doser directement l'analyte recherché. C'est pourquoi, après synthèse des substances étalons, nous avons pu développer, pour la 1ère fois, une méthode de dosage des dérivés glucuronides et sulfates du BPA et du Cl2BPA dans l'urine. Ce travail propose, à travers notamment le développement de méthodes d'analyse, des outils fiables pour la mesure de l'exposition aux PE.

Les antibiotiques sont actuellement parmi les médicaments les plus utilisés, mais les schémas thérapeutiques optimaux ne sont pas toujours bien définis. Le but de cette thèse était de développer des modèles pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PK/PD) décrivant les profils de concentrations des antibiotiques ainsi que leurs effets et le développement de résistances bactériennes afin d’optimiser les schémas thérapeutiques.
Un modèle PK de population sur la colistine et sa prodrogue, le colistine methanesulfonate (CMS), a été développé chez les patients recevant la colistine par voie aérosol et/ou sous hémodialyse (HD). Les résultats ont montré un net avantage de la voie aérosol pour le traitement des infections pulmonaires avec une dose de 2 MUI de CMS. Pour les patients sous HD une dose de 1.5 MUI de CMS 2 fois par jour est recommandée avec une dose supplémentaire de 1.5 MUI de CMS après chaque séance de HD.
L’évaluation des performances de différents modèles PK/PD via à une approche par simulation a montré l’importance d’effectuer des études suffisamment longues ainsi que d’obtenir des données microbiologiques complémentaires afin de décrire le développement de la résistance bactérienne.
Un modèle PK/PD incluant taux de mutation et résistance adaptative à la colistine d’une souche bioluminescente de Pseudomonas aeruginosa a été développé à partir de données in-vitro. Une résistance rapide, importante et partiellement réversible a été décrite. Ces résultats confirment l’importance des 24 premières heures dans le traitement des infections, que la colistine seule ne peut pas complétement éliminer les mutants de Pseudomonas aeruginosa et que des associations semblent nécessaires.