UPThèses

L'ischémie reperfusion se caractérise par deux phases distinctes : une cessation puis un retour de l’apport sanguin et peut se produire dans certaines situations pathologiques et lors de la transplantation d’organes. Cette séquence d’évènements peut induire la mort cellulaire, la formation de débris cellulaires et de microparticules. Les corps apoptotiques et les microparticules se caractérisent par l’exposition de la phosphatidylsérine sur le feuillet externe de leur membrane. Les cellules lésées suite à l’ischémie reperfusion entraînent, par le relargage de cytokines/chimiokines, l’activation de l’inflammation et le recrutement de leucocytes, tel que les macrophages. Les macrophages permettent l’élimination par phagocytose des débris cellulaires et des microparticules. Il a été établi précédemment que le récepteur tyrosine kinase MerTK, exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages, joue un rôle majeur dans la phagocytose. En effet, l’interaction du récepteur MerTK avec son ligand, la protéine S, permet la formation d’un pont entre le macrophage et les phosphatidylsérines exposées par les corps apoptotiques et les microparticules. MerTK contribue aussi à une régulation négative de l’expression de certaines molécules pro-inflammatoires impliquées dans le recrutement leucocytaire. L’objectif de notre étude est de caractériser le rôle de MerTK dans le développement des lésions induites par une ischémie reperfusion rénale mais aussi dans la réparation post-ischémique. Nous avons utilisé un modèle de rats RCS (Royal College of Surgeons) caractérisés par un MerTK défectueux en raison d’une mutation naturelle dans le gène MerTK. La simulation de l’ischémie reperfusion rénale s’effectue par le clampage de l’artère et de la veine rénale. Le sang et les reins prélevés permettent d’évaluer, via des techniques d’ELISA, de Western Blot et de dosages biochimiques, des marqueurs de la fonction et de lésions rénales, d’inflammation et de recrutement leucocytaire. Les lésions histologiques sur des coupes rénales sont mises en évidence par les colorations HES-PAS, et la localisation ainsi que la quantification du recrutement leucocytaire ont été évaluées par la technique d’immunohistochimie. Nous avons par ailleurs utilisé la technique de cytométrie en flux pour quantifier les microparticules d’origine plaquettaires, endothéliales et leucocytaires dans le plasma. Enfin, nous avons étudié le rôle possible de MerTK dans la phagocytose in vitro, par co-incubation de corps apoptotiques avec des monocytes/macrophages, provenant de sang de rats RCS déficients en MerTK ou de rats contrôles exprimant normalement ce récepteur.

Il est prouvé que la conservation des greffons rénaux marginaux en machine de perfusion (MP) est bénéfique. Cependant, cette méthode nécessite des améliorations afin de minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion (I/R), par l’ajout d’oxygène et/ou d’un transporteur d’oxygène. Nous avons cherché à évaluer les effets de l’oxygénation et de l’ajout d’une hémoglobine de ver marin (HbAm, M101) durant la perfusion rénale hypothermique avant transplantation. Nos critères de jugement étaient basés sur la reprise de fonction du greffon et sur les lésions tardives de dysfonction rénale. Nous avons utilisé un modèle porcin : les reins ont été exposés à 1h d’ischémie chaude, puis perfusés dans une MP WAVES® pendant 23h à 4°C avant autotransplantation. Quatre groupes ont étudié : W (MP-21% O2), W-O2 (MP-100% O2), W-M101 (MP-21% O2 + 2g/L HbAm), W-O2+M101 (100% O2 + 2g/L HbAm), (n=6 per groupe). Les reins du groupe W-M101 ont montré un débit de perfusion plus élevé et une résistance rénale plus faible comparé aux autres groupes. Pendant la première semaine post-transplantation, les groupes W-O2 et W-M101 ont montré une créatininémie significativement plus faible et un meilleur taux de filtration glomérulaire (GFR). Les niveaux circulants de KIM-1 et IL-18 étaient plus faibles dans le groupe W-M101, tandis que les niveaux de NGAL et d’ASAT étaient plus faibles dans les groupes d’oxygénation active. Trois mois post-transplantation, la fraction excrétée de sodium et le ratio protéinurie/créatininurie étaient plus élevé dans le groupe W. La créatininémie était plus faible dans le groupe W-M101. La fibrose interstitielle a évalué à 3 mois post-transplantation étaient plus faible dans les groupes W-M101 et W-O2+M101. Nous avons révélé histologiquement que l’infiltration de mastocytes était significativement élevée dans le groupe W comparé aux autres groupes. Nous avons montré que la combinaison de 21% O2 + hémoglobine améliorent la reprise de fonction du greffon rénale.

Le carcinome épidermoïde cutané (CEC) est l'un des cancers les plus fréquents et il est résistant aux traitements chimiothérapeutiques classiques. De nombreuses études montrent que selon leur phénotype les cellules du microenvironnement inflammatoire peuvent inhiber (cellules Th1/M1) ou favoriser (cellules Th2/M2) le développement tumoral. En fonction des cytokines présentes dans ce microenvironnement, il est possible de reprogrammer les cellules immunitaires et de les rendre moins permissives au développement tumoral. L’onconstatine M (OSM) est une cytokine aux effets pléiotropes, elle peut favoriser la prolifération, l’invasion tumorale des cellules tumorales et induire une polarisation immunitaire Th2/M2. Nous avons montré que l'OSM a des effets pro-inflammatoires au niveau cutané et qu’elle module le phénotype des kératinocytes normaux mais son rôle dans les CEC n’est pas décrit. Nous avons donc étudié l’implication de l'OSM dans le développement des CEC. Nous avons montré que l'OSM était surexprimée dans les CEC humains ainsi que d'autres cytokines comme l'IL-6, l'IL-1β, l'IFNγ suggérant une polarisation Th1/M1 des cellules du microenvironnement. In vitro, l'OSM induit l’activation de voies de signalisation pro-tumorales (STAT3 - ERK) au niveau de kératinocytes murins malins ainsi que leur prolifération et leur migration. La greffe de ces cellules chez la souris entraine le développement de CEC associés à une surexpression d'OSM. Enfin, l’absence d'OSM entraine une diminution du volume tumoral de 30% et à une réduction de la polarisation M2. Collectivement, ces résultats suggèrent un rôle pro-tumoral de l'OSM dans le développement des CEC et le blocage de cette cytokine pourrait constituer une nouvelle alternative thérapeutique.

OBJECTIF : L’intégrité vasculaire est une pierre angulaire de la viabilité des organes solides, notamment en cas de transplantation. L’objectif de ce travail est de décrire les modifications du réseau vasculaire du cortex rénal dues à une séquence d’ischémie-reperfusion (IR) induite dans un modèle préclinique porcin d’autotransplantation rénale. MATÉRIELS ET MÉTHODES : Nous avions mis en place une technique d’analyse de la microvascularisation corticale rénale après acquisition microscanner et traitement des images de reins de porc perfusés avec un polymère de silicone radio-opaque. RÉSULTATS : L’ischémie-reperfusion rénale induit une diminution corticale du volume du segment vasculaire associée à une raréfaction des microvaisseaux inférieurs à 30 µm en particulier dans la corticale interne. Dans le cortex, une augmentation de la connectivité caractérisée par une augmentation des bifurcations et une diminution du facteur d’arborescence a été observée. L’hypercholestérolémie associée à l’ischémie-reperfusion entraine une raréfaction microvasculaire dans la corticale moyenne. Trois mois post-autotransplantation, l’augmentation de la durée de conservation des greffons induit une augmentation significative de l’épaisseur de la zone corticale, un effondrement du pourcentage de microvaisseaux. CONCLUSION : Trois mois après autotransplantation rénale, l’ischémie-reperfusion induit une raréfaction des microvaisseaux de la corticale interne. Nos résultats suggéreraient que l’altération de la fonction rénale chez des greffons pourrait être liée à une hypoxie chronique et une fibrose induite par une raréfaction microvasculaire proportionnelle à la durée de la conservation.

En préservation-transplantation rénale, l’ischémie-reperfusion (IR) induit inflammation, fibrose, dysfonction et perte du greffon. Les événements d’IR sont de mieux en mieux identifiés, mais leurs complexité limite prédiction et thérapeutique. A partir d’une analyse bibliographique détaillée, nous proposons un modèle par agents de la réponse rénale aux lésions d’IR au niveau cellulaire/tissulaire, réalisé avec l'outil de modélisation NetLogo. Dans un premier temps, nous développons un modèle dynamique de l’oxygénation du cortex rénal, avec apport et diffusion de l’oxygène (O2), et consommation dépendant de la filtration. Nous adaptons ce modèle à l’état stationnaire pour l’O2, puis nous couplons les niveaux de PO2 à l'état énergétique (ATP) des cellules épithéliales et endothéliales (avec voies aérobie et anaérobie). Le statut de viabilité cellulaire est lié au niveau d'ATP, aboutissant à une représentation semi-phénoménologique de la réparation/survie vs apoptose/nécrose. Enfin, nous explorons le destin cellulaire et tissulaire lors d’IR simulées, avec l’ajout progressif d’éléments clefs de l’inflammation (invasion tissulaire par leucocytes, signaux lésionnels, phagocytose) et de la fibrose (fibroblastes, collagène). L’évolution du modèle vers la résolution de l’inflammation/régénération du tissu ou vers la fibrose tissulaire est observée selon les conditions imposées (durée/intensité, ischémie vs hypoxémie). Cette construction constitue le premier modèle des effets de l’oxygénation sur la dynamique cellulaire-tissulaire de l’inflammation-fibrose rénale en réponse à l’IR. A terme, elle permettra d'aborder clinique et thérapeutique de la conservation-transplantation rénale.

Le psoriasis apparait aujourd’hui comme une pathologie systémique en lien avec le syndrome métabolique et son expression hépatique, la stéatopathie hépatique métabolique (SHM), soulevant la question d’un dialogue entre le foie et la peau au cours du psoriasis ; les phénomènes inflammatoires systémiques chez les patients psoriasiques pourraient induire une hépatite chronique d’évolution fibrosante, et inversement, la prévalence augmentée de la SHM au cours du psoriasis pourrait aggraver la sévérité de l’atteinte cutanée. Nous avons étudié l’impact d’une SHM pré-existante sur la dermatite psoriasiforme murine induite par l’application topique d’imiquimod (IMQ), un agoniste des récepteurs de type Toll 7 et 8. La présence d’une SHM est associée à une aggravation de la dermatite et nous montrons une production cutanée d’interleukine-17A permettant d’expliquer l’exacerbation de la dermatite secondairement induite. Dans le second travail, en parallèle d’une évaluation de la fibrose hépatique dans une cohorte de patients psoriasiques, nous avons étendu le traitement topique par IMQ à 9 semaines afin de reproduire la chronicité du psoriasis. Alors que la sévérité du psoriasis est associée à une augmentation de la fibrose hépatique chez certains patients, la dermatite chronique expérimentale évolue vers une hépatite péri-portale avec une activation des cellules stellaires hépatiques, à l’origine d’une fibrose hépatique débutante. En conclusion, nous démontrons l’interrelation entre le psoriasis et le système immun hépatique, ceci devant inciter les praticiens à intégrer le dépistage de la SHM et de la fibrose hépatique dans la prise en charge du psoriasis.

La transplantation rénale, thérapie de choix de l'insuffisance rénale chronique terminale, est limitée par une pénurie d'organes. Les greffons issus de donneurs décédés par arrêt cardiaque (DDAC) peuvent contribuer à pallier à cette pénurie au prix de stratégies thérapeutiques visant à améliorer l'issue de la transplantation. Les cellules souches mésenchymateuses (MSC) de l'organisme adulte ont des propriétés de sécrétion, d'immunomodulation et de différenciation intéressantes dans ce contexte. L'objectif de ce travail est d'évaluer, dans un modèle pré-clinique porcin de DDAC, le potentiel thérapeutique de deux populations cellulaires d'intérêt : les MSC issues du liquide amniotique (AFSC) et les cellules de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux (SVF). Les AFSC porcines injectées dans l'artère rénale 7 jours post-greffe, en raison de leur sensibilité à une séquence d'hypoxie réoxygénation (HR) in vitro, accélèrent la reprise de fonction et réduisent l'extension des lésions chroniques du greffon et sont détectées dans le rein 24h après injection. La SVF porcine, phénotypiquement proche de celle de l'Homme, est moins sensible à cette séquence d'HR et peut être injectée dans l'artère du greffon à sa reperfusion sans perturbation du flux sanguin rénal, avec une rétention des cellules dans le rein 24h post injection. Ce travail met en évidence le rôle bénéfique des AFSC dans la réparation des lésions ischémie-reperfusion des greffons issus des DDAC, ainsi que la faisabilité de l'injection de la SVF dans l'artère rénale après transplantation, et ouvre des pistes pour l'optimisation les protocoles d'administration de produits de thérapie cellulaire en transplantation.

L'ischémie-reperfusion (IR) est un syndrome associant un arrêt de la perfusion sanguine suivie de son rétablissement au sein d'un organe. L'IR est rencontrée dans de nombreuses pathologies telles que le syndrome coronarien aigu, la chirurgie vasculaire mais également durant la transplantation d'organes solides au moment de la préservation de l'organe. L'ischémie entraîne de nombreux désordres métaboliques générant un stress cellulaire parmi lequel deux organelles sont particulièrement touchées : la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE). Notre projet de recherche visait à comprendre l'impact du stress du RE et de sa réponse, appelée Unfolded Protein Response (UPR), au cours de l'IR. Nous avons étudié la cinétique d'activation et le rôle de chacune des voies de l'UPR – IRE1α–XBP1, PERK-eIF2α-ATF4 et ATF6 – dans la survie des cellules endothéliales artérielles humaines soumises à différentes durées d'IR. Nous avons observé une activation successive des voies PERK-eIF2α-ATF4, ATF6 et IRE1α-XBP1 en fonction de la durée de l'ischémie froide. À l'aide de méthodes bioinformatiques, d'agents pharmacologiques et de techniques d'extinction génique post-transcriptionnelle (siRNA) nous avons observé que la voie ATF6 était délétère, que la voie PERK-eIF2α-ATF4 était protectrice lorsqu'elle était maintenue activée durant l'ischémie et que la voie IRE1α-XBP1 avait un rôle dual. Par extrapolation à la clinique, nos résultats indiquent que l'UPR est une voie d'intérêt thérapeutique pour optimiser la survie des greffons ainsi que la qualité de vie des patients et que ses médiateurs pourraient permettre d'estimer la qualité du greffon lors de la transplantation.

Un réseau de cytokine complexe a été décrit dans le psoriasis mettant en évidence le rôle central des cytokines proinflammatoires dans la physiopathologie de cette maladie. Notre tentative de modéliser l'inflammation cutanée a montré que la combinaison de l'IL-17A, IL-22, IL-1α, oncostatine M (OSM) et le TNFα, augmente de manière synergique l'expression de chimiokines et de peptides antimicrobiens, reflétant certaines caractéristiques du psoriasis. D'autres caractéristiques de cette maladie sont l'acanthose et le blocage de la différenciation des kératinocytes. Notre premier objectif était d'étudier le rôle respectif de ces cytokines sur la différenciation des kératinocytes en comparaison avec les lésions de patients psoriasiques. Toutes ces cytokines inhibent l'expression des marqueurs de différentiation des kératinocytes, parmi lesquelles l’IL-22 et l’OSM sont les plus puissantes et le mélange M5 présente des effets synergiques. Si l'IL-22 et l'OSM déclenchent plus spécifiquement l'hyperplasie épidermique et le blocage de la différenciation, l’IL-1α, IL-17A et le TNFα sont plutôt impliqués dans l'activation de l'immunité innée. Le rôle fonctionnel de chacune de ces cytokines in vivo a été étudié dans un modèle d'inflammation cutanée de type psoriasique induit par l'imiquimod (IMQ), un agoniste TLR7, en utilisant des souris déficientes en cytokines. L'absence de l'OSM ou de l'OSMRβ n'a pas modifié le développement des lésions inflammatoires induites par l’IMQ. Une hypothèse est que d'autres cytokines peuvent avoir des effets redondants avec l'OSM. L'absence de l'IL-22 chez la souris diminue partiellement les lésions cutanées induites par l'IMQ, démontrant que son retrait du réseau cytokinique rompt une partie des effets synergiques des cytokines in vivo comme présenté dans le modèle M5. L'absence de l'IL-1α ou de l'IL-1β ne modifie pas l'inflammation cutanée induite par l'IMQ, ce qui n'est pas surprenant au vu des activités redondantes de ces deux cytokines. La diminution partielle de l'inflammation en absence d'IL-1α ET d'IL-1β OU de la chaine réceptrice commune IL-1RI confirme ces observations. A long terme ces études devraient permettre de proposer des stratégies anti-cytokine ciblées et combinées pour tenter de rompre la synergie et diminuer ainsi toutes les composantes de la réponse inflammatoire cutanée.

La pénurie d’organes est un problème majeur en transplantation, aussi, en France, depuis 2005 sont autorisés les prélèvements sur donneurs décédés après arrêt cardiaque (DDAC). Cependant, ces organes sont soumis à d’importantes lésions d’ischémie reperfusion, en particulier liés à la coagulation induite par la stase. La formation de microthrombi entraîne à la reperfusion un défaut d’irrigation qui aboutit à la mort celullaire. Parallèlement, l’endothélium rénal amplifie la coagulation par l’expression du facteur tissulaire. Ce processus engendre une synthèse accrue de molécules pro-inflammatoires via les PAR (Protease-Activated-Receptors) activés par les facteurs IIa et Xa. Dans le cadre de ce travail, nous avons évalué in vivo, dans un modèle porcin d’autotransplantation rénale, l’effet de deux molécules anticoagulantes de synthèse, l’une anti-Xa et l’autre combinant un effet anti-Xa et IIa. Le modèle préclinique était composé d’une période d’ischémie chaude suivie d’une conservation de 24h à 4°C en UW, modèle sévère mimant les lésions observées chez le DDAC. L’utilisation de ces anticoagulants en périconservation, a permis de réduire les lésions de fibrose et le l’inflammation responsables de la perte de greffon rénal à long terme. In vitro, les effets bénéfiques de la molécule anti-Xa+IIa, seraient dus à une limitation de l’activation endothéliale et une réduction de l’inflammation. En conclusion, l’ajout de ces anticoagulants durant la conservation des greffons a montré un bénéfice sur la reprise de fonction et sur la réduction des dysfonctions chroniques des greffons.