UPThèses

La résistance aux antibiotiques est devenue un problème de santé publique majeur faisant l’objet de mesures au niveau national et européen. La logique économique n’incitant pas les grands groupes pharmaceutiques à investir dans la recherche en infectiologie, les résistances apparaissent plus vite que les nouveaux antibiotiques, créant des situations d’impasses thérapeutiques. Ainsi, dans ce contexte de pénurie, des antibiotiques plus anciens comme les polymyxines, souvent délaissés à cause de leur toxicité, constituent parfois le traitement de dernier recours. La polymyxine B est l’un des principaux antibiotiques utilisés pour lutter contre les infections pulmonaires causées par les souches multirésistantes d’Acinetobacter baumannii, rencontrées chez les patients de réanimation. Cependant, plusieurs paramètres peuvent influencer l’efficacité des antibiotiques, comme par exemple la densité bactérienne au site infectieux qui varie au cours du temps : en cas de traitement et/ou de réponse immunitaire efficaces la densité bactérienne diminue, dans le cas contraire, elle augmente. Or, une forte densité bactérienne est souvent associée à une diminution de l’efficacité des antibiotiques : ce phénomène microbiologique est appelé l’effet inoculum. Ainsi dans ce travail, l’impact de la taille de l’inoculum d’A. baumannii sur la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de la polymyxine B a été évalué à travers deux études principales : 1. L’étude pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) in vitro de la polymyxine B contre une souche clinique d’A. baumannii sensible à la polymyxine B. Pour cela, des courbes de bactéricidie sur 30h en présence de polymyxine B (0,125 à 128 mg/L) et de quatre inocula croissants d’A. baumannii (105 à 108 UFC/mL) ont été réalisées. Ces données expérimentales ont montré un effet inoculum marqué notamment après analyse des résultats par des approches PK/PD semi-mécanistiques. En effet, l’effet inoculum a été caractérisé dans le modèle par une augmentation de la concentration permettant l’obtention de 50% de l’effet maximal (EC50) de la polymyxine B par un facteur 17 en présence du plus fort inoculum, comparativement au plus faible. Afin de comprendre les mécanismes d’adaptation à la polymyxine B mis en place par A. baumannii, un séquençage du génome entier et une évaluation de l’expression des principaux gènes de résistance décrits chez ce germe ont été réalisés. Ces expérimentations ont montré que la résistance adaptative observée n’était pas due à la mise en place de ces mécanismes. 2. L’étude PK/PD in vivo de la polymyxine B dans deux modèles de référence d’infection à A. baumannii. Dans premier temps, les modèles murins neutropéniques d’infection de la cuisse et d’infection pulmonaire ont été mis au point. Puis, l’efficacité in vivo sur 24h de la polymyxine B administrée par voie sous-cutanée a été étudiée. Ces deux modèles ont montré que l’efficacité de la polymyxine était supérieure dans le modèle d’infection de la cuisse que dans le modèle d’infection pulmonaire. De plus, une étude d’effet inoculum d’A. baumannii (106 et 107 UFC/cuisse) en présence de polymyxine B a été réalisée in vivo chez la souris présentant une infection de la cuisse. Cette étude PD a ensuite été couplée à une étude PK qui a été réalisée à 3 doses (1, 15 et 40 mg/kg) afin de déterminer les paramètres PK de la polymyxine B. Ces données PK/PD in vivo ont été initialement analysées avec le modèle PK/PD semi-mécanistique développé à partir des données in vitro. Le modèle in vitro ne permettant pas de décrire correctement les données in vivo, un nouveau modèle a été développé à partir des données in vivo. Les résultats préliminaires montrent que l’effet inoculum d’A. baumannii sur l’efficacité de la polymyxine B est moins important in vivo. Des expérimentations supplémentaires avec un troisième inoculum sont à prévoir afin de mieux caractériser cet effet inoculum in vivo.

L’addiction aux drogues est une maladie comportementale récidivante caractérisée par une recherche et une prise compulsive de drogues, une perte de contrôle sur la prise malgré les conséquences négatives et l’émergence d'un état émotionnel négatif lors de l’absence de la drogue. L’addiction implique des neuroadaptations cérébrales persistantes. Des études récentes montrent que le cholestérol joue un rôle crucial dans le fonctionnement cérébral en participant à divers processus cellulaires et, en particulier, au contrôle de la neurotransmission. L’objectif de ce travail de thèse consistait à étudier l’implication potentielle du métabolisme du cholestérol dans l’addiction et en particulier si ce métabolisme était affecté par les drogues d’abus. Dans ce travail, nous avons étudié l’expression de gènes codant des protéines impliquées dans le métabolisme du cholestérol cérébral après une consommation volontaire chronique d’alcool par des rats et après des injections aigues ou chroniques de cocaïne. Nous avons analysé l’expression de ces gènes dans des structures cérébrales impliquées dans l’addiction, notamment le cortex préfrontal, le noyau accumbens, l’amygdale et l’hippocampe. Nous avons trouvé que l’exposition à l’alcool et à la cocaïne modifient l’expression des protéines impliquées dans la synthèse, le transport et la dégradation du cholestérol de façon spécifique de la drogue, du traitement (aigu/chronique) et de la région cérébrale étudiée. Dans une deuxième partie de la thèse, nous avons utilisé une approche virale permettant de surexprimer la CYP46A1, l’enzyme de dégradation du cholestérol cérébral dans le cortex préfrontal afin d’évaluer l’impact de cette surexpression sur la recherche de cocaïne dans un modèle de rechute. La surexpression de la CYP46A1dans cette structure n’a eu aucun impact sur la recherche de cocaïne. Des études futures seront nécessaires pour déterminer si l’altération de l’expression de cette enzyme dans d’autres structures, comme par exemple le noyau accumbens, pourrait avoir des effets bénéfiques sur la rechute. L’ensemble de ces travaux montrent que l’exposition aux drogues d’abus modulerait le métabolisme cérébral du cholestérol dans certaines structures cérébrales. Ce projet de thèse ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle du métabolisme du cholestérol cérébral dans l’addiction, et il pourrait en résulter de nouvelles thérapeutiques dans le traitement de cette maladie psychiatrique coûteuse.

La lutte contre les bactéries multirésistantes est une priorité majeure définie par l’Organisation Mondiale de la Santé, puisque les dernières prédictions estiment que les infections par des bactéries multirésistantes feront plus de morts que le cancer d’ici 2050. Dans le contexte actuel, avec un faible nombre de nouveaux antibiotiques mis sur le marché pour lutter contre les bactéries multirésistantes, il est important de d’optimiser l’utilisation des antibiotiques à notre disposition. C’est dans ce but que les modèles semi-mécanistiques servant à analyser les résultats d’études de PK/PD des antibiotiques peuvent être développés. Ces outils mathématiques permettent de quantifier les relations concentration-effet, de molécules seules ou de combinaisons de molécules afin d’optimiser leur efficacité, prévenir les résistances et donc prolonger la durée de vie des antibiotiques. Dans ce travail, après une présentation des méthodes d’étude de la PK/PD des antibiotiques seuls et en combinaison, les résultats de deux projets sont présentés : 1. Une étude de la PK/PD de la céfoxitine contre une souche de Mycobacterium abscessus. Dans une première partie, il a été montré que l’administration de la céfoxitine par nébulisation permet d’obtenir des concentrations pulmonaires 1000 fois plus importantes qu’après une administration intraveineuse, faisant de la céfoxitine un bon candidat à la nébulisation. Dans la seconde partie un modèle PK/PD semi-mécanistique a été développé à partir de données in vitro, ce qui permet d’identifier la relation concentration-effet pour deux sous-populations bactériennes tout en tenant compte de la dégradation de la molécule. 2. Une étude de la PK/PD de l’association polymyxine B et minocycline contre une souche d’Acinetobacter baumannii résistante à la polymyxine B. Cette étude in vitro comprend des données de bactéricidie avec suivi de la densité de bactéries résistantes à la polymyxine B, enrichies d’expériences complémentaires servant à préciser les caractéristiques de cette sous-population résistante. Ces données ont toutes été analysées par modélisation PK/PD semi-mécanistique, ce qui a notamment permis de quantifier l’importance de l’interaction entre les deux molécules et de formuler des hypothèses sur les mécanismes de cette interaction.

Pseudomonas aeruginosa (PA) et Acinetobacter baumannii (AB) sont responsables d'infections pulmonaires chroniques souvent associées à la formation de biofilms, i.e. des agrégats bactériens piégés dans une matrice riche en polymères anioniques tels que l'alginate ou l’ADN. Au sein de ces biofilms, la diffusion des antibiotiques cationiques (ATB), tels que la tobramycine (TOB) et la colistine (COL), est en partie réduite due aux interactions avec les polymères de la matrice. Les principaux objectifs de cette thèse ont été dans un premier temps de développer un modèle de biofilm pulmonaire mimant ceux retrouvés dans les infections pulmonaires chroniques des patients atteints de mucoviscidose (CF), l'une des principales maladies pulmonaires dans laquelle ces biofilms se développent. Un nouveau système d’administration d'ATB, composé de nanoparticules lipidiques chargées de COL, a été par la suite développé et testé grâce à ce modèle de biofilms pulmonaires. Chez les patients atteints de CF, PA forme des biofilms constitués d'agrégats (50-100 μm) incorporés dans leur mucus pulmonaire. Un modèle de biofilm pulmonaire in vitro composé des polymères présents in vivo (alginate, mucines, ADN) et constitué de PA piégés dans des billes d'alginate, a été développé et évalué à l'aide de la COL et de la TOB. Ce modèle a été optimisé en évaluant l'effet de la taille des billes et du milieu de croissance dans lequel elles ont été dispersées. La modification de la taille des billes de 60 à 1200 µm et l'utilisation d'un milieu de dispersion simulant la composition du mucus pulmonaire ont permis de réduire davantage l'efficacité de la TOB dans ce modèle. Pour des concentrations élevées en TOB, des variants de PA formant de très petite colonies (SCV), également trouvés chez les patients atteints de CF, ont été observés dans le modèle, ce qui suggère une bonne imitation des conditions in vivo. Dans ce modèle, l'efficacité de la COL a été moins affectée que celle de la TOB, et aucune SCV a été observé. Des nanoparticules lipidiques PEGylées chargées de COL et contenant un adjuvant lipophile à la COL tel que le farnésol ont été développées pour augmenter son efficacité contre les biofilms. L'encapsulation de la COL a amélioré son efficacité par un facteur deux dans le modèle de biofilm pulmonaire à PA précédemment développée. Ces nanoparticules ont permis également de restaurer la sensibilité à la COL d'une souche résistant d’AB et ont amélioré son efficacité dans un modèle de biofilm d’AB formé sur une surface abiotique.

Introduction L’IL-33 joue un rôle d’alarmine dans l’initiation de la réponse inflammatoire aux lésions d’ischémie-reperfusion (I/R) rénale, impliquant les lymphocytes “invariant natural killer” (iNKT). Objectifs Déterminer si l’IL-33 agit également comme une alarmine en I/R hépatique et évaluer la contribution de l’IL-33 et des cellules iNKT dans le recrutement des granulocytes neutrophiles et des monocytes/macrophages après IR. Méthodes Nous avons choisi un modèle d’ischémie chaude hépatique par clampage à 70% du foie de souris C57BL/6 sauvages, déficientes en IL-33 (IL-33 KO) ou déficientes en cellules iNKT (Jalpha18 KO). La sévérité des lésions d’I/R a été évaluée par dosage plasmatique des ALAT et analyse histologique des lobes de foie clampés. L’IL-33 a été déterminée dans le sang et le foie, respectivement par ELISA et western blot et sa néo-synthèse par RT-PCRq. Le recrutement des cellules immuno-inflammatoires dans le foie après IR a été analysé par cytométrie en flux. Résultats Chez les souris sauvages, l’IL-33 était constitutivement exprimée dans les cellules endothéliales des sinusoïdes et des veinules portes du foie et était immédiatement libérée pendant la phase d’ischémie dans la circulation sanguine sans néo-synthèse. Quatre heures après la reperfusion, les lésions d’I/R étaient diminuées chez les souris déficientes en IL-33, comparativement aux souris sauvages. Ainsi, dès les premières heures après l’ischémie, l’IL-33 agit comme une alarmine et est en partie responsable des lésions d’I/R. Les lésions d’I/R étaient également diminuées chez les souris déficientes en cellules iNKT, tandis que chez les souris sauvages, les cellules iNKT étaient activées en périphérie (dans la rate) et recrutées localement. Les granulocytes neutrophiles et les monocytes/macrophages étaient recrutés dans le foie après une heure de reperfusion chez les souris sauvages, alors que ce recrutement était significativement réduit chez les souris déficientes en IL-33 et chez les souris déficientes en iNKT, suggérant qu’à la fois l’IL-33 et les iNKT contribuent au recrutement de cellules immuno-inflammatoires. Cet ensemble de résultat est conciliable avec l’existence d’un axe IL-33/iNKT intervenant dans les phases précoces de l’inflammation lors de l’I/R hépatique. Conclusion L’IL-33, en tant qu’alarmine, contribue précocement aux lésions d’I/R hépatique. L’IL-33 pourrait agir en mobilisant les cellules iNKT, lesquelles avec l’IL-33, amplifieraient le recrutement des cellules immuno-inflammatoires. L’IL-33 représente donc une cible thérapeutique essentielle pour réduire les lésions d’I/R en transplantation hépatique.

Les parabènes, reconnus comme perturbateurs endocriniens, sont couramment utilisés en tant que conservateurs dans l’alimentation et les cosmétiques mais également dans les médicaments. Selon l’hypothèse de la DOHAD (Developmental Origins of Health And Diseases), l’exposition pré- et périnatale à ces composés est un facteur de risque de développer des maladies chroniques plus tard dans la vie. Les nouveau-nés, et plus particulièrement les prématurés, constituent une population particulièrement vulnérable à ces substances du fait de l’immaturité de leur métabolisme et de la poursuite du développement à cette période de vie, notamment concernant leur système endocrinien. Néanmoins, l’exposition des nouveau-nés aux parabènes n’a été que très peu étudiée, en particulier l’exposition à travers l’administration des médicaments. L’objectif de cette thèse est d’étudier l’exposition des nouveau-nés aux parabènes via l’administration des médicaments. Pour cela, nos travaux ont consisté à : (i) Identifier les médicaments utilisés en pédiatrie contenant des parabènes et estimer l’exposition aux parabènes à l’aide d’une cohorte de plus de 8000 nouveau-nés hospitalisés dans les établissements de santé français ; (ii) Mettre au point une méthode de dosage sanguin ultrasensible des parabènes, adaptée à cette population afin d’évaluer la part attribuable aux médicaments dans l’exposition aux parabènes ; et (iii) Proposer des stratégies alternatives permettant de limiter cette exposition dans la prise en charge de ces nouveau-nés. Nos résultats montrent une exposition significative des nouveau-nés, qu’ils soient prématurés ou nés à terme, à trois parabènes. Plus de 50% des nouveau-nés ont été exposés au moins une fois au méthyle et au propylparabène, cette fréquence d’exposition diminue avec l’âge gestationnel à la naissance. Cette tendance a été également retrouvé également pour l’éthylparabène. Les valeurs moyennes d’exposition étaient de 0,654 ± 0,892, 0,256 ± 0,261 et 0,097 ± 0,136 mg/kg/j pour le méthyle, l’éthyle et le propylparabène respectivement. Cette exposition est retrouvée dans tous les établissements de santé étudiés et des différences significatives ont été observés en fonction de l’âge gestationnel à la naissance. Les nouveau-nés à terme et les très grands prématurés (<28 semaines d’aménorrhée) sont particulièrement exposés au méthyle et au propylparabène, tandis que l’exposition à l’éthylparabène concerne essentiellement les nouveau-nés à terme. Trente médicaments ont été impliqués dans l’exposition des nouveau-nés aux parabènes, avec des différences d’utilisation entre les centres. Nos recherches ont montré que certains d’entre eux peuvent être substitué, soulignant la nécessité de prise en compte de ces éléments dans le référencement des médicaments. Pour d’autres, des changements de pratiques et une modification des formules galéniques par les industriels est nécessaire pour limiter l’exposition de ces enfants. Concernant les possibilités de substitution, nous avons développé et évalué la stabilité de préparations hospitalières sans parabènes sur une durée de 60 jours, afin de proposer une alternative sans parabènes pour des molécules n’existant pas avec une forme galénique adapté chez le nouveau-né. Enfin, la méthode de dosage ultrasensible mise au point a été validée selon les critères internationaux, permettant de doser les parabènes de façon fiable sur un faible volume d’échantillon (50 µL). Son applicabilité a été démontrée sur des échantillons plasmatiques issus de nouveau-nés. Au final, ces travaux apportent un éclairage complet sur l’exposition des nouveau-nés aux parabènes en démontrant que les médicaments sont une source non-négligeable d’exposition. Nous apportons également des solutions alternatives dont la mise en œuvre permettra de diminuer cette exposition durant l’hospitalisation des nouveau-nés.

Le syndrome CHARGE (CS) est une maladie génétique rare caractérisée par de nombreuses anomalies congénitales, majoritairement causées par des altérations de novo du gène CHD7. Celui-ci code pour une protéine à chromodomaines, impliquée dans le remodelage ATP-dépendant de la chromatine. La grande majorité des altérations de CHD7 consiste en allèles nuls tels que des délétions, des substitutions non-sens ou des décalages du cadre de lecture. Nous avons réalisé le premier diagnostic moléculaire d’un patient Indonésien atteint du CS, en étudiant un panel de gènes (CHD7, EFTUD2, et HOXA1) par NGS (next-generation sequencing). Nous avons identifié une nouvelle mutation non-sens hétérozygote dans l’exon 34 du gène CHD7 (c.7234G>T ou p.Glu2412Ter). Par ailleurs, il n'existe pas d’analyse fonctionnelle qui permettrait de caractériser la pathogénicité des variants de la protéine CHD7 rencontrés chez des patients. C’est pourquoi l’objectif de ce travail est de mettre au point un test fonctionnel de la protéine CHD7, sous forme sauvage ou mutée. Pour cela, nous avons généré par mutagénèse dirigée des vecteurs codant pour trois variants faux-sens de CHD7 et le variant présentant une insertion de cinq acides aminés. Ensuite, les protéines CHD7, sous forme sauvage ou variante, ont été surexprimées dans la lignée HeLa. L’expression des protéines a été mise en évidence par western blot et par immunofluorescence. Pour étudier la fonctionnalité de CHD7, nous avons quantifié par RT-qPCR les transcrits de cinq gènes (l’ADNr 45S, SOX4, SOX10, MYRF, et ID2), dont la transcription est selon le littérature régulée par CHD7. Nous avons observé que l’expression de CHD7 sauvage entraînait une diminution significative et reproductible des quantités de transcrits correspondant à tous les gènes rapporteurs. Par contre, l’expression des quatre allèles variants de CHD7 n’avait aucun impact, ce qui suggère que ces variants ne sont pas fonctionnels. Par ailleurs, nous avons appliqué notre test biologique dans des cellules de la lignée SH-SY5Y, pour lesquelles nous avons introduit une mutation faux-sens dans le génome en utilisant la technique CRISPR/Cas9. Lorsque ce variant était exprimé, les niveaux de transcription des cinq gènes rapporteurs n’étaient pas significativement différents de ceux observés dans les cellules où les deux allèles de CHD7 avaient été invalidés. Par conséquent, les variants étudiés peuvent être répertoriés comme résultant de mutations causales du CS.

Chez les patients atteints de pathologies pulmonaires obstructives, le rétrécissement du calibre des bronches peut induire des perturbations fonctionnelles ventilatoires comme la limitation de débit expiratoire (LDE) et/ou l’hyperinflation pulmonaire (HP). Dans un tel contexte, l’équilibre métabolique pourrait être perturbé au sein du tissu musculaire intercostal, notamment à l’exercice, ce qui pourrait favoriser la survenue ou l’aggravation de la dyspnée. Pour simuler les perturbations ventilatoires que peuvent rencontrer les patients atteints de pathologies pulmonaires obstructives (e.g. résistance anormalement élevée des voies aériennes à l’expiration, LDE et HP), une pression expiratoire positive (PEP) de 20 cmH2O a été imposée au repos et à l’exercice chez des sujets sains. L’oxygénation des muscles intercostaux a été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau du 7ème espace intercostal. Au repos, une diminution de la concentration en oxyhémoglobine ([O2Hb]) probablement liée à une baisse de la concentration en hémoglobine totale ([tHb], i.e. volume sanguin local) a été observée en réponse à la PEP (Étude 1). Toutefois, aucune diminution de l’indice de saturation tissulaire en oxygène (TSI) n’a été constatée (Études 1 à 3), y compris lorsque la PEP était à l’origine d’une HP (Étude 2). A l’exercice, une moindre augmentation de [O2Hb] et de [tHb] a été rapportée lorsque la PEP était imposée (vs. contrôle). Une diminution du TSI et de la capacité inspiratoire a aussi été observée entre le repos et l’exercice dans cette condition (Étude 3). D’après les résultats de nos études, lorsqu’une PEP de 20 cmH2O est imposée au repos chez de jeunes sujets sains, aucun déséquilibre métabolique ne semble se produire au niveau des muscles intercostaux. En revanche, lorsque cette PEP est imposée à l’exercice, une perturbation de l’équilibre métabolique semble avoir lieu. Cette dernière pourrait être en partie expliquée par des altérations hémodynamiques locales induites par l’HP. Toutefois, des études complémentaires sont nécessaires pour éclaircir cet aspect. Enfin, aucune relation entre la dyspnée et la condition métabolique des muscles intercostaux n’a été observée lors de nos études. En revanche, des corrélations entre l’inconfort respiratoire et les débits ventilatoires instantanés ont été mises en évidence au repos et à l’exercice lorsque la PEP était imposée (Études 1 et 3). Une relation entre la dyspnée et l’HP a aussi été observée au repos (Étude 2). Les travaux de recherche futurs auront pour objectif de vérifier, au repos et à l’exercice, si l’oxygénation des muscles intercostaux est influencée par l’HP chez des patients atteints de pathologies pulmonaires obstructives.

La mucormycose pulmonaire est une infection fongique invasive grave affectant les patients immunodéprimés. Le traitement de référence fait appel à l’amphotéricine B (AmB) liposomale mais reste peu efficace avec environ 50% de mortalité malgré celui-ci. Le but de cette thèse était d’optimiser le traitement préventif et curatif de la mucormycose pulmonaire. Pour cela, cette thèse a été structurée en 2 axes, un axe préventif puis un axe curatif, eux-mêmes divisés en deux sous-parties. La première partie de l’axe « préventif » s’intéressait au phénomène de réactivation des infections fongiques invasives. Ce concept a été décrit dans un premier article. Son postulat est le suivant : suite à une primo-infection asymptomatique, une seconde infection peut se produire à distance à la faveur d’une immunodépression. Un modèle murin a été développé pour reproduire ce concept et évaluer l’intérêt de l’AmB en décolonisation pour prévenir ce phénomène de réactivation. L’AmB en décolonisation s’est révélé efficace pour prévenir la survenue de la maladie. La seconde partie de cet axe avait pour but d’étudier le rôle des corticoïdes dans la physiopathologie de l’infection. Pour ce faire, un modèle ex vivo qui consiste à administrer des corticoïdes à des souris, puis à récupérer les cellules pulmonaires par lavage broncho-alvéolaire a été mis au point. Les perturbations induites par les corticoïdes sur les cellules immunitaires ont ensuite été étudiées in vitro. Les corticoïdes ont diminué la capacité globale des macrophages alvéolaires à inhiber la filamentation du champignon, diminué la capacité de phagocytose des macrophages alvéolaires et leur capacité de « killing » oxydatif. La première partie de l’axe « curatif » a consisté à développer un modèle murin de mucormycose pulmonaire aigüe afin d’étudier la physiopathologie de cette infection. Ce modèle a été caractérisé sur les plans histologiques et immunitaires et permettra d’explorer la relation champignon-hôte-antifongique. La seconde partie de cet axe a permis d’évaluer in vitro des associations entre AmB et diverses molécules afin d’améliorer l’efficacité de l’AmB. Ces combinaisons ont été testées par technique de chequerboard sur différentes souches de Mucorales. Après avoir passé au crible 20 candidats (antibiotiques, antifongiques, alcools terpéniques, tensioactifs), un a été identifié, le PEG15HS, qui permet de diminuer les concentrations minimales inhibitrices d’AmB

L’ischémie-reperfusion est un phénomène physiopathologique complexe, indissociable de la transplantation rénale, et induisant des lésions pouvant conduire à la dysfonction de l’organe à court et moyen terme et potentiellement à sa perte. Les reins issus de donneurs décédés après arrêt circulatoire ainsi que ceux issus de donneurs à critères étendus, dont l’utilisation ne fait qu’augmenter, sont des greffons particulièrement sensibles à ces lésions ; parmi les stratégies visant à contrôler celles-ci, notre étude vise à tester une thérapie cellulaire innovante basée sur des exosomes dérivés de Cellules Progénitrices Urinaires porcines (pUPCs) combinée à une perfusion hypothermique en machine de perfusion (HMP) suivie d’une perfusion normothermique ex vivo en machine de perfusion (NMP). Les pUPCs ont été isolées et caractérisées par cytométrie en flux, immunofluorescence et western blotting. Les exosomes dérivés de pUPCs ont été isolés par ultracentrifugation et caractérisés par western blotting, microscopie électronique et par nanotracking assay. Les reins porcins, prélevés à l’abattoir, ont été soumis à 32 min d’ischémie chaude puis conservés en HMP pendant 24 heures à 4°C. Par la suite, les reins ont été perfusés ex vivo en normothermie oxygénée durant 5h à 37°C. Pour la thérapie cellulaire, des exosomes dérivés de pUPCs (Exo) ont été injectés via l’artère rénale porcine. Trois groupes expérimentaux ont été réalisés (n = 5-6/groupe) : Groupe 1 : HMP/véhicule + NMP/véhicule, Groupe 2 : HMP/Exo + NMP/véhicule, Groupe 3 : HMP/Exo + NMP/Exo. Les analyses effectuées comprennent notamment des paramètres fonctionnels et histologiques, les analyses de l’expression des protéines/cytokines dans les perfusats ainsi que l’effet des perfusats sur des cultures de cellules aortiques porcines in vitro. Tout d’abord, les pUPCs ont été isolées et amplifiées à partir d’échantillons d’urine porcine. Les pUPCs isolées expriment des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses comme CD90 et sont négatives pour CD31 (marqueur endothélial) et CD45 (marqueur de cellules souches hématopoïétiques). Les pUPCs ont la capacité d’acquérir un phénotype épithélial (expression d’E-cadhérine) après différenciation en cellules tubulaires avec la présence de transporteurs d’eau (AQP1 et AQP2). Les exosomes dérivés de pUPCs expriment des marqueurs exosomaux Alix et TSG101, ont une taille attendue (30-100 nm de diamètre) et sont délimités par une double membrane. L'injection d'exosomes dérivés de pUPCs pendant 24 heures de HMP est faisable, n’impactant pas négativement les paramètres de perfusion, mais aucune différence significative n'a été montrée (analyse en fin de HMP). L'injection d'exosomes pendant la NMP est également possible et n'a pas d'impact significatif sur le débit de perfusion, la résistance rénale, la consommation d'oxygène, la prise de poids des reins, la production d'urine, la fonction rénale (créatinine et sa clairance) et le niveau d'ATP. Cependant, certains marqueurs de lésions cellulaires sont diminués dans le Groupe 3 (ASAT, LDH) et les analyses des perfusats de NMP montrent que l’injection d’Exo induit une immunomodulation (diminution des cytokines pro-inflammatoires (IL1α, IL1β, IL8) et augmentation de la cytokine anti-inflammatoire IL1RA). In vitro, la présence d’exosomes au sein des perfusats permet d’augmenter l’activité mitochondriale de cellules endothéliales porcines en culture. Des analyses métabolomiques et transcriptomiques sont en cours afin de comprendre le mécanisme d’action de ces vésicules. Cette étude montre la faisabilité et l’intérêt potentiel d’utiliser des exosomes dérivés de pUPCs pour le conditionnement du greffon rénal ex vivo. Ces résultats doivent être évalués sur un modèle de transplantation rénale porcine.