UPThèses

Introduction L’IL-33 joue un rôle d’alarmine dans l’initiation de la réponse inflammatoire aux lésions d’ischémie-reperfusion (I/R) rénale, impliquant les lymphocytes “invariant natural killer” (iNKT). Objectifs Déterminer si l’IL-33 agit également comme une alarmine en I/R hépatique et évaluer la contribution de l’IL-33 et des cellules iNKT dans le recrutement des granulocytes neutrophiles et des monocytes/macrophages après IR. Méthodes Nous avons choisi un modèle d’ischémie chaude hépatique par clampage à 70% du foie de souris C57BL/6 sauvages, déficientes en IL-33 (IL-33 KO) ou déficientes en cellules iNKT (Jalpha18 KO). La sévérité des lésions d’I/R a été évaluée par dosage plasmatique des ALAT et analyse histologique des lobes de foie clampés. L’IL-33 a été déterminée dans le sang et le foie, respectivement par ELISA et western blot et sa néo-synthèse par RT-PCRq. Le recrutement des cellules immuno-inflammatoires dans le foie après IR a été analysé par cytométrie en flux. Résultats Chez les souris sauvages, l’IL-33 était constitutivement exprimée dans les cellules endothéliales des sinusoïdes et des veinules portes du foie et était immédiatement libérée pendant la phase d’ischémie dans la circulation sanguine sans néo-synthèse. Quatre heures après la reperfusion, les lésions d’I/R étaient diminuées chez les souris déficientes en IL-33, comparativement aux souris sauvages. Ainsi, dès les premières heures après l’ischémie, l’IL-33 agit comme une alarmine et est en partie responsable des lésions d’I/R. Les lésions d’I/R étaient également diminuées chez les souris déficientes en cellules iNKT, tandis que chez les souris sauvages, les cellules iNKT étaient activées en périphérie (dans la rate) et recrutées localement. Les granulocytes neutrophiles et les monocytes/macrophages étaient recrutés dans le foie après une heure de reperfusion chez les souris sauvages, alors que ce recrutement était significativement réduit chez les souris déficientes en IL-33 et chez les souris déficientes en iNKT, suggérant qu’à la fois l’IL-33 et les iNKT contribuent au recrutement de cellules immuno-inflammatoires. Cet ensemble de résultat est conciliable avec l’existence d’un axe IL-33/iNKT intervenant dans les phases précoces de l’inflammation lors de l’I/R hépatique. Conclusion L’IL-33, en tant qu’alarmine, contribue précocement aux lésions d’I/R hépatique. L’IL-33 pourrait agir en mobilisant les cellules iNKT, lesquelles avec l’IL-33, amplifieraient le recrutement des cellules immuno-inflammatoires. L’IL-33 représente donc une cible thérapeutique essentielle pour réduire les lésions d’I/R en transplantation hépatique.

Les cellules iNKT et T CDS innées sont présumées contribuer à l'irnmunosurveillance (IS) des cancers et sont fonctionnellement déficientes dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Notre hypothèse était que ces défauts résultent de l'incapacité des cellules dendritiques myéloïdes (mDC) à les activer. Des analyses par cytométrie en flux et microscopie confocale ont révélé une baisse de l'expression membranaire de CD 1 d, qui présente les antigènes aux cellules iNKT, à la surface des mDC des patients LMC, par comparaison aux sujets sains. Ce défaut n'est associé ni à un défaut de maturation des mDC, comme le montre l'expression normale de HLA-DR et de CDS6, ni à une baisse d'expression intracellulaire de CDld ou de son transcrit. Ces résultats sont conciliables avec une rétention intracellulaire. Le traitement in vitro des mDC des patients LMC avec un inhibiteur de la protéine ROCK restaure partiellement l'expression de surface de CD 1 d et la présentation antigénique par CD Id, alors qu'il n'a eu aucun effet sur les mDC des sujets sains. Nous proposons que la protéine ROCK, qui est activée par le domaine DH-PH de BCR-ABL, interfere avec la réponse immunitaire dépendant des lymphocytes iNKT au cours de la LMC par régulation négative de l'expression membranaire de CDld des mDC. Le fait que les cellules iNKT et T CDS innées retrouvent des fonctions normales après rémission complète de la LMC est en faveur d'une génération de cellules T CD8 innées dépendante des cellules iNKT, comme décrit chez la souris. Notre travail suggère une implication des cellules iNKT et T CD8 innées dans l'IS de la LMC et révèle l'axe ROCK/mDC comme une nouvelle cible thérapeutique dans la maladie.

Nous avons récemment identifié chez l’Homme une nouvelle sous population lymphocytaire T constituée par les lymphocytes T (LT) CD8 innés. Ils possèdent un TCRαβ, expriment le facteur de transcription Eomesodermine, les récepteurs membranaires KIR/NKG2A et sont dotés de fonctions de type « Natural Killer » (NK-like). Leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles sont compatibles avec leur définition comme potentiel équivalent humain des LT CD8 « innate memory » décrits chez la souris, dont la génération dépend de la sécrétion de l’IL-4 par les LT exprimant le facteur de transcription « promyelocytic leukemia zinc finger protein » (PLZF), notamment les lymphocytes « invariant Natural Killer T » (iNKT). Nous avons pris appui sur le modèle physiopathologique de la leucémie myéloïde chronique (LMC) pour tester l’implication potentielle des LT CD8 innés dans l’immunosurveillance antitumorale chez l’Homme. Ce choix repose sur le fait qu’en matière de cancers, la LMC constitue un modèle d’étude du rôle du système immunitaire, comme l’attestent les données de la littérature documentant que les lymphocytes sont capables de contrôler la maladie. La LMC est une hémopathie maligne de la famille des syndromes myéloprolifératifs qui résulte de la formation d’un gène chimérique BCR-ABL1, lequel est responsable de l’expression d’une protéine dont l’activité tyrosine kinase est dérégulée. Le traitement de la LMC repose sur une thérapie ciblée non curative : les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) dont le chef de file est l’imatinib. Nous avons précédemment montré que les lymphocytes iNKT, une sous population T innée dont l’implication dans l’immunosurveillance antitumorale est clairement établie chez l’Homme et la Souris, sont anergiques chez les patients en LMC au diagnostic de la maladie. Leur défaillance fonctionnelle, notamment en termes de sécrétion d’IL-4, est corrigée chez les patients obtenant une rémission cytogénétique complète sous traitement par imatinib. Tout comme pour les lymphocytes iNKT, nos résultats montrent au diagnostic de la maladie un déficit numérique profond des LT CD8 innés, auquel s’ajoute une altération sévère de leurs fonctions NK-like (capacité de sécrétion d’IFN-γ en réponse à une combinaison de cytokines pro-inflammatoires IL-12+IL-18 et de cytotoxicité via CD16). De manière intéressante, nous avons observé chez les patients traités par imatinib et en rémission moléculaire majeure (RMM), une restauration numérique et fonctionnelle partielle en termes de sécrétion d’IFN-γ de type inné des LT CD8 innés. Les données collectées chez les témoins sains, les patients au diagnostic de la maladie et en RMM sous ITK, en mettant en évidence une association entre la fréquence des lymphocytes iNKT et celle des LT CD8 innés, renforcent l’hypothèse de l’existence chez l’Homme, à l’instar de chez la Souris, d’un axe iNKT/ LT CD8 innés. Pour éprouver notre hypothèse que les LT CD8 innés participent au contrôle de la LMC, nous avons analysé leur statut chez des patients en rémission prolongée après arrêt de leur ITK en dépit de la persistance d’une maladie résiduelle tumorale. Chez ces patients, un taux significativement plus élevé de LT CD8 innés est mis en évidence comparativement aux patients en RMM sous ITK et aux témoins sains. Leurs capacités fonctionnelles sont, de plus, restaurées de manière complète en référence aux sujets sains. L’ensemble de ces résultats qui plaide en faveur d’une implication des LT CD8 innés dans l’immunité anti-leucémique au cours de la LMC, nous conduits à émettre l’hypothèse qu’ils pourraient constituer un biomarqueur potentiel du succès d’arrêt du traitement par ITK dans la LMC et nous encouragent à explorer des stratégies d’immunothérapie antitumorale visant à valoriser leurs propriétés fonctionnelles.

Les lymphocytes T (LT) CD8 innés sont une population de LT non conventionnels récemment décrits dans le laboratoire. On les qualifie de « non conventionnels » car ils possèdent des caractéristiques de l’immunité acquise (facteur de transcription Eomesodermine et phénotype T mémoire) mais aussi de l’immunité innée (récepteurs des cellules NK, réponse à une stimulation cytokinique de type inné). Les fonctions de ces cellules sont encore peu connues, même s’il existe un faisceau d’argument en faveur de leur implication dans l’immunité anti-infectieuse et anti-tumorale. Il a été décrit que l’immuno-sénescence et/ou la stimulation antigénique chronique (induite par exemple par les infections virales chroniques au cytomégalovirus ou CMV) entraîne(nt) l’expression de marqueurs NK par les LT. Ce phénotype se rapproche donc de celui de nos cellules d’intérêt. Pour étudier l’effet de la stimulation antigénique chronique sur le compartiment LT CD8, et spécialement sa composante innée, nous avons choisi comme modèle la transplantation d’organe. Dans ce domaine, la recherche s’intéresse aux populations immunitaires susceptibles de jouer un rôle dans la tolérance ou le rejet du greffon. Parmi elles, les LT CD8 innés méritent une attention spéciale, ceci du fait de leurs fonctions innées effectrices/cytotoxiques. Nous avons présumé leur (re)programmation par la stimulation antigénique chronique (du greffon et/ou virale) pendant la transplantation. Cette hypothèse a été testée à partir d’une cohorte de patients transplantés rénaux depuis plus de dix ans, sous traitement immunosuppresseur minimisé (ciclosporine A (CsA) en monothérapie), en l’absence de signe clinico-biologique de rejet. Notre travail a d’abord permis de révéler dans les LT CD8 innés issus des donneurs sains (DS) un phénotype sénescent accentué (fréquence de cellules CD27(-)CD28(-) augmentée) que les LT CD8 conventionnels. En outre, la fréquence de cette population T innée, contrairement aux LT CD8 conventionnels, ne corrélait pas avec l’âge. Dans la cohorte de patients transplantés, nous avons observé une augmentation de la fréquence des LT CD8 innés, accompagnée d’un phénotype sénescent et effecteur terminal (CD45RA(+)CCR7(-)) exacerbé, comparativement aux cellules des DS. Les patients présentant une sérologie positive pour le CMV avaient un phénotype sénescent accru par rapport aux patients présentant une sérologie négative. En altérant la signalisation du TCR, le traitement immunosuppresseur CsA pourrait faciliter la (re)programmation des LT CD8 en faveur de leur versant inné. En accord avec cette hypothèse, une modélisation in vitro des effets de la CsA sur les LT CD8 provenant de DS en présence d’une stimulation du TCR et d’IL-15 a permis de documenter une augmentation du pool de LT CD8 innés au détriment du pool de LT naïfs, laquelle est accompagnée d’une valorisation de leurs fonctions (production innée d’IFN-γ). A l’inverse, chez les patients, les LT CD8 innés étaient dysfonctionnels, avec une production innée d’IFN-γ diminuée qui pourrait résulter de leur expression membranaire diminuée du récepteur de l’IL-15, cytokine indispensable aux LT CD8 innés. Ce dysfonctionnement, qui ne peut être attribué à un programme d’exhaustion ni être relié à un antécédent de cancer, pose la question du rôle de la stimulation allo-spécifique chronique. De façon générale, ce travail suggère que le contexte d’allogreffe rénale entraîne une reprogrammation et un phénotype de type « vieillissement » des LT CD8 innés, liés au moins en partie au traitement immunosuppresseur. Cette hypothèse devra être confortée par une analyse fine de l’allo-spécificité des LT CD8 innés dirigée contre le greffon.

Le syndrome d'ischémie-reperfusion (IR), inhérent à la transplantation rénale, est caractérisé par un infiltrat leucocytaire important et des lésions tissulaires graves dont les signaux initiateurs restent à ce jour peu décrits. Postulant que la libération d'alarmines par les cellules en nécrose est décisive dans ce processus, l'objectif principal du présent travail a été d'étudier la contribution de l'alarmine IL-33 dans la genèse des lésions tissulaires dans un modèle murin d'IR rénale. Nos résultats montrent que l'IL-33 est rapidement libérée du rein après IR comme protéine circulante, dès une heure de reperfusion. Les souris IL-33gt/gt, déficientes en IL-33, sont moins sensibles aux lésions induites par l’IR, comme l'attestent le maintien de la fonction rénale et des lésions histologiques atténuées avec un recrutement de polynucléaires neutrophiles (PNN) diminué par rapport aux souris contrôles. Ceci est associé à la perte du recrutement de cellules iNKT productrices d'IFN-γ/IL-17A. Parallèlement, les souris Jα18KO, déficientes en cellules iNKT et protégées contre les lésions d'IR, possèdent également des niveaux élevés d'IL-33 circulante. Nous proposons donc que l'IL-33 endogène contribue aux lésions d'IR en favorisant le recrutement de cellules iNKT, conduisant ainsi à un recrutement amplifié de PNN au niveau du rein lésé. Notre étude, en identifiant l'alarmine IL-33 comme un médiateur précoce de la réponse immunitaire innée induite par l'IR rénale, mettant en jeu les cellules iNKT, contribue à la compréhension des mécanismes impliqués dans la genèse des lésions associées à la greffe rénale et permet de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne caractérisée par un syndrome myéloprolifératif. Elle est secondaire à la formation d’un gène chimérique BCR-ABL dont le produit de ce gène de fusion est une protéine possédant une activité tyrosine kinase dérégulée, nécessaire et suffisante à la leucémogénèse. Plusieurs arguments suggèrent l’implication des cellules du système immunitaire dans le contrôle de la LMC. Nous avons montré que les lymphocytes Natural Killer T invariant (iNKT), une population minoritaire de lymphocytes T non conventionnels impliqués dans l’immunosurveillance, sont anergiques chez les patients en phase chronique (LMC-PC). Ce défaut est corrigé chez les patients en rémission cytogénétique complète après traitement par Imatinib Mesylate (LMC-IM) ou IFN-α. Les lymphocytes iNKT sont impliqués chez la Souris dans la génération de cellules T CD8+ « innate-memory », une autre population de lymphocytes T innés découverte récemment chez la Souris. Nous avons mis en évidence chez l’Homme, l’existence d’une population de cellules T ayant un phénotype inné et mémoire, exprimant fortement le facteur de transcription Eomesodermine et capable de produire rapidement de l’IFN-γ en réponse à une stimulation innée par les interleukines (IL)-12 et IL-18. Cette population de cellules est déficiente sur le plan numérique et fonctionnel chez les patients LMC-PC. Ces défauts sont partiellement corrigés chez les patients LMC-IM. L’ensemble de ces résultats souligne le rôle des lymphocytes T innés dans l’immunité anti-leucémique et pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapies ciblées contre la LMC.

La transplantation rénale (TR) est la stratégie thérapeutique de choix pour les insuffisances rénales terminales. L'utilisation de greffons de donneurs à critères étendus, tels les sujets diabétiques, est devenue une nécessité face à la pénurie de greffons, malgré le risque accru de dysfonction du greffon. L'ischémie/reperfusion (I/R) est une étape inhérente à la TR. Le diabète est un facteur de risque pour le développement de lésions rénales aiguës mais les mécanismes d'action mis en jeu restent à élucider. Il existe peu de données expérimentales sur les conséquences délétères du diabète sur les lésions d'I/R rénales. Nous avons fait l'hypothèse que l'IL-33, en tant qu'alarmine, joue un rôle clé au carrefour qui lie l'hyperglycémie à l'I/R. L'objectif de ce travail a été d'étudier l'effet de la délétion du récepteur ST2 de l'IL-33 sur les lésions d'I/R rénales dans un contexte hyperglycémique. Nous avons utilisé un modèle d'I/R rénale chez des souris transgéniques dépourvues du récepteur ST2. Le diabète type 1 a été induit par la streptozotocine. Nous avons démontré que la délétion du récepteur ST2 a un effet néphroprotecteur en situation euglycémique, suggérant un effet exacerbateur de l'IL-33 sur les lésions d'I/R rénales. Cette protection rénale a été perdue en condition hyperglycémique. L'ensemble de ces résultats suggère que l'IL-33, en tant qu'alarmine, a des effets différentiels en fonction de l'environnement hyperglycémique. Sur le plan clinique, compte tenu de l'impact néfaste du diabète sur le rein, nos résultats conduisent à proposer d'étudier la place d'IL-33 dans l’inflammation chronique associée au diabète et de ses conséquences sur la fonction rénale.