UPThèses

Les chimères Bcr-Abl sont dues à une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22, entrainant la fusion des gènes bcr et abl. La seule différence structurale entre p190bcr﷓abl, associé avec la Leucémie Aigue Lymphoblastique, et p210bcr-abl, responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique, réside dans le domaine DH/PH présent uniquement dans p210bcr-abl. Nous avons montré précédemment que Rac1 était activée dans les cellules exprimant p190bcr-abl et p210bcr-abl alors que RhoA n'est activé que dans les cellules exprimant p210bcr-abl (Harnois et al., Oncogene, 2003). Les cellules Ba/F3 parentales ne sont pas spontanément mobiles contrairement aux cellules Ba/F3p210 and Ba/F3p190. Les cellules exprimant p210bcr-abl présentent des mouvements amoeboïdes typiques alors que les cellules exprimant p190bcr-abl utilisent une mobilité de type roulement (rolling-type). Les résultats obtenus en utilisant des mutants des domaines GEF de Vav ou p210bcr-abl nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Vav, en complexe avec Bcr-Abl, est responsable à travers l'activation de Rac1 du déclenchement de la motilité des cellules exprimant Bcr-Abl. Le GEF de p210bcr-abl, spécifique de l'activation de RhoA, est indispensable pour la formation des mouvements amoeboïdes dans les cellules Ba/F3, mais ne joue pas de rôle dans le déclenchement de la mobilité spontanée de ces cellules (Daubon et al., Oncogene, 2008). Nous avons ensuite caractérisé une voie passant par Rac1/PAK1/LIMK1/cofiline1 dans laquelle chaque élément est essentiel pour le déclenchement de la motilité dite rolling-type. Nous avons montré que la voie classique RhoA/ROCK/MLC était seulement partiellement impliquée dans l'induction de la motilité amoeboïde dans les cellules Ba/F3p210. De façon surprenante, nous avons trouvé que RhoA et ROCK1 induisent l'activation de l'isoforme ADF/destrine de la famille des " Actin Depolymerizing Factors ", à travers la régulation négative de la LIMK2 au niveau transcriptionnel mais aussi par une dégradation protéasome-dépendante. Cette voie de signalisation originale permet une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires menant aux mouvements amoeboïdes en 3 dimensions.

Les oncogènes Bcr-Abl (p190bcr-abl et p210bcr-abl) sont issus d'une translocation chromosomique t(9,22) qui fusionne en phase les gènes bcr et c-abl. p210bcr-abl est généralement responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) alors que p190bcr-abl induit un sous type de Leucémie Aigue Lymphoblastique (LAL). La seule différence structurale entre ces deux protéines est la présence d'un domaine DH/PH au sein de p210bcr-abl activateur spécifique de RhoA. L'expression de Bcr-Abl dans la lignée Ba/F3 est associée au déclenchement d'une migration spontanée, dépourvue de directionnalité, sous la dépendance de la GTPase Rac1. L'activation de RhoA, spécifique des cellules Ba/F3p210, est associée à un phénotype migratoire amœboïde dans une matrice de Matrigel™ en 3D où les cellules Ba/F3p190 dépourvues de RhoA activé, présentent une mobilité de type roulement. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que l'activation spécifique de ROCK1 par RhoA détermine deux voies parallèles et mutuellement indispensables pour le mouvement amœboïde : 1) la voie de la Chaine Légère de Myosine (CLM) 2) celle des protéines de la famille ADF (Actin Depolymerizing Factor), et plus particulièrement l'isoforme ADF/destrine. Nous démontrons également l'existence d'invadopodes spécifiquement dans les cellules Ba/F3p190, dont la formation est sous la dépendance de l'absence d'activation de RhoA corrélée à une augmentation de l'activation de Cdc42. Enfin nous démontrons que la voie de signalisation RhoA/ROCK est spécifiquement activée dans les progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issus de patients atteints de LMC et ce, indépendamment de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl.

La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresser vers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à la dégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisation.

La méthode de préservation d’organes la plus utilisée actuellement en transplantation rénale est la conservation statique en hypothermie. Cependant, ce mode de conservation induit des dommages inhérents aux lésions du syndrome d’ischémie/reperfusion (I/R). Cette étude a eu pour objectif d’identifier de nouvelles conditions de préservation des greffons, afin de limiter les lésions d’I/R, en modulant la température de conservation ou par ajout d’un transporteur d’oxygène. Nous avons utilisé deux modèles : in vitro avec des cellules endothéliales et in vivo en autotransplantation rénale chez le porc. Les résultats ont confirmé les effets délétères de la conservation à 4°C contrairement à des conservations à 19°C, 27°C et surtout 32°C, permettant d’obtenir une activité métabolique, une viabilité et une intégrité cellulaire supérieures ainsi qu’une diminution des marqueurs de l’inflammation et du stress oxydant. Nous avons aussi démontré les bénéfices d'un nouveau transporteur d’oxygène, M101, dans deux des solutions de conservation les plus utilisés, UW et HTK. L'utilisation de M101 en conservation statique permet une meilleure reprise de fonction à court terme et une réduction de la fibrose, cause principale de la perte du greffon. Enfin, nous avons montré une conservation des bénéfices de M101 à des doses réduites et déterminé que cette protection était due à une multifonctionnalité de la molécule, combinant un transporteur d’oxygène, une activité superoxyde dismutase et une taille importante (permettant de réguler la pression oncotique). Ce travail a montré de nouvelles pistes de réflexion vers une préservation, et donc une qualité, supérieure des organes à transplanter.

Actuellement les transplanteurs sont confrontés à une pénurie de greffons, conduisant à l'élargissement des critères de choix des donneurs. Cette démographie fait place à des greffons plus sensibles aux lésions d'ischémie-reperfusion (I/R). Ces lésions conduisent à des dysfonctions de reprises de fonction des greffons, et participent à l'augmentation de l'immunogénicité du greffon et à l'emergence de rejets aigus et chroniques. Dans un premier temps, il est donc nécessaire de limiter les lésions d'I/R et conserver l'intégrité du greffon. Dans un deuxième temps, il est important de réduire l'immunogénicité du greffon et de contrôler le rejet de greffe tout en maintenant le receveur immunocompétent. Afin de limiter les lésions d'I/R nous avons évalué la solution de préservation SCOT de type extracellulaire contenant 30g/L de PEG 20kDa, dans un modèle murin d'isolement et de transplantation d'îlots pancréatiques. L'amélioration des conditions de conservation a permit de préserver l'intégrité des îlots et de réduire l'immunogénicité du greffon, et ce due aux propriétés immunoprotectrices des PEG 20kDa (effets obtenus pour 10 à 30g/L). Dans ce même modèle notre second objectif était d'établir un état de tolérance périphérique par déplétion transitoire des lymphocytes T alloréactifs. La déplétion des lymphocytes T en division a été induite au moment de l'allotransplantation des îlots, par administration transitoire d'un analogue nucleosidique inductible. La déplétion transitoire a permit d'aboutir à une immunotolérance dominante via l'émergence de lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+FoxP3+, cellules ouvrant de nouvelles perspectives dans l'inhibition des rejets d'allogreffes.

La pénurie d'organes a amené les équipes de transplantation à élargir l'acceptation des greffons à des organes provenant de donneurs marginaux. Le recours aux greffons marginaux impose de réduire les lésions induites durant l'IR, et doit conduire à une prise en charge optimisée de façon à limiter le risque de PNF et de RRF. C'est face à cette situation, que la question de la perfusion d'organe et de l'utilisation des machines de perfusion s'est posée et a justifié la réalisation de ce travail. Un modèle d'autotransplantation chez le porc a été choisi car il permet d'évaluer les effets de l'IR sur le rein. Les reins ont subi une ischémie contrôlée. La conservation des reins a été randomisée soit en incubation statique dans IGL-1 ou Belzer MPS soit sur machine de perfusion. Nous avons utilisé comme paramètre d'étude : la survie des animaux, différents dosages biologiques, une analyse histologique et une évaluation immunologique par RTqPCR des certains gènes impliqués dans le mécanisme lésionnel d'IR. Nos résultats montrent au total : -Que la machine de perfusion RM3 diminue le risque de RRF et PNF post greffe. -La supériorité de l'IGL-1 sur le Belzer MPS ; il existe un effet propre de la solution IGL-1 pour moduler les mécanismes inflammatoires et immunologiques liés aux lésions d'IR. -Que la reprise de fonction et la PNF dépendent du liquide utilisé et qu'il existe un effet d'addition entre l'IGL-1 et la machine de perfusion.

Afin de mieux comprendre le mécanisme physiopathologique et inflammatoire impliqué dans la fièvre Méditerranéenne familiale (FMF), nous avons étudié le profil cytokinique ex vivo monocytaire et lymphocytaire des patients FMF. Nous avons ensuite étudié l’implication potentielle dans la FMF de la protéine RAC1, qui semble jouer un rôle dans la production de l’IL-1β, d’une part, et dans la production du stress oxydant, d’autre part. Enfin, nous avons recherché une association potentielle entre les gènes IL-1β et IL-1RA et la susceptibilité et/ou la sévérité de la maladie. La première partie de l’étude a porté sur 34 patients FMF génétiquement confirmés, dont 9 ont été prélevés à deux reprises, en crise et hors crise, et 24 sujets sains. Les marqueurs inflammatoires MBL et CRP ont été dosés dans le sérum par ELISA, et les cytokines ont été quantifiées par Luminex dans le sérum et les surnageants de culture de PBMC de patients et des contrôles avec ou sans stimulation des monocytes par LPS et des lymphocytes par anti-CD3/CD28. Dans la deuxième partie de ce travail, une étude comparative des niveaux d’expression du gène RAC1 chez les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles a été effectuée par PCR quantitative en temps réel. L’IL-1β et l’IL-6 ont été dosées par ELISA en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1 dans les surnageants de culture de PBMC, avec ou sans stimulation par LPS. La quantification des marqueurs du stress oxydant a été effectuée dans le plasma ainsi que dans les surnageants de culture de PMN stimulés ou non par LPS, en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1. Les génotypes au niveau des 3 polymorphismes à la position -511, -31 et +3954 d

La pénurie d’organes est un problème majeur en transplantation, aussi, en France, depuis 2005 sont autorisés les prélèvements sur donneurs décédés après arrêt cardiaque (DDAC). Cependant, ces organes sont soumis à d’importantes lésions d’ischémie reperfusion, en particulier liés à la coagulation induite par la stase. La formation de microthrombi entraîne à la reperfusion un défaut d’irrigation qui aboutit à la mort celullaire. Parallèlement, l’endothélium rénal amplifie la coagulation par l’expression du facteur tissulaire. Ce processus engendre une synthèse accrue de molécules pro-inflammatoires via les PAR (Protease-Activated-Receptors) activés par les facteurs IIa et Xa. Dans le cadre de ce travail, nous avons évalué in vivo, dans un modèle porcin d’autotransplantation rénale, l’effet de deux molécules anticoagulantes de synthèse, l’une anti-Xa et l’autre combinant un effet anti-Xa et IIa. Le modèle préclinique était composé d’une période d’ischémie chaude suivie d’une conservation de 24h à 4°C en UW, modèle sévère mimant les lésions observées chez le DDAC. L’utilisation de ces anticoagulants en périconservation, a permis de réduire les lésions de fibrose et le l’inflammation responsables de la perte de greffon rénal à long terme. In vitro, les effets bénéfiques de la molécule anti-Xa+IIa, seraient dus à une limitation de l’activation endothéliale et une réduction de l’inflammation. En conclusion, l’ajout de ces anticoagulants durant la conservation des greffons a montré un bénéfice sur la reprise de fonction et sur la réduction des dysfonctions chroniques des greffons.

Un réseau de cytokine complexe a été décrit dans le psoriasis mettant en évidence le rôle central des cytokines proinflammatoires dans la physiopathologie de cette maladie. Notre tentative de modéliser l'inflammation cutanée a montré que la combinaison de l'IL-17A, IL-22, IL-1α, oncostatine M (OSM) et le TNFα, augmente de manière synergique l'expression de chimiokines et de peptides antimicrobiens, reflétant certaines caractéristiques du psoriasis. D'autres caractéristiques de cette maladie sont l'acanthose et le blocage de la différenciation des kératinocytes. Notre premier objectif était d'étudier le rôle respectif de ces cytokines sur la différenciation des kératinocytes en comparaison avec les lésions de patients psoriasiques. Toutes ces cytokines inhibent l'expression des marqueurs de différentiation des kératinocytes, parmi lesquelles l’IL-22 et l’OSM sont les plus puissantes et le mélange M5 présente des effets synergiques. Si l'IL-22 et l'OSM déclenchent plus spécifiquement l'hyperplasie épidermique et le blocage de la différenciation, l’IL-1α, IL-17A et le TNFα sont plutôt impliqués dans l'activation de l'immunité innée. Le rôle fonctionnel de chacune de ces cytokines in vivo a été étudié dans un modèle d'inflammation cutanée de type psoriasique induit par l'imiquimod (IMQ), un agoniste TLR7, en utilisant des souris déficientes en cytokines. L'absence de l'OSM ou de l'OSMRβ n'a pas modifié le développement des lésions inflammatoires induites par l’IMQ. Une hypothèse est que d'autres cytokines peuvent avoir des effets redondants avec l'OSM. L'absence de l'IL-22 chez la souris diminue partiellement les lésions cutanées induites par l'IMQ, démontrant que son retrait du réseau cytokinique rompt une partie des effets synergiques des cytokines in vivo comme présenté dans le modèle M5. L'absence de l'IL-1α ou de l'IL-1β ne modifie pas l'inflammation cutanée induite par l'IMQ, ce qui n'est pas surprenant au vu des activités redondantes de ces deux cytokines. La diminution partielle de l'inflammation en absence d'IL-1α ET d'IL-1β OU de la chaine réceptrice commune IL-1RI confirme ces observations. A long terme ces études devraient permettre de proposer des stratégies anti-cytokine ciblées et combinées pour tenter de rompre la synergie et diminuer ainsi toutes les composantes de la réponse inflammatoire cutanée.

L'ischémie-reperfusion (IR) est un syndrome associant un arrêt de la perfusion sanguine suivie de son rétablissement au sein d'un organe. L'IR est rencontrée dans de nombreuses pathologies telles que le syndrome coronarien aigu, la chirurgie vasculaire mais également durant la transplantation d'organes solides au moment de la préservation de l'organe. L'ischémie entraîne de nombreux désordres métaboliques générant un stress cellulaire parmi lequel deux organelles sont particulièrement touchées : la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE). Notre projet de recherche visait à comprendre l'impact du stress du RE et de sa réponse, appelée Unfolded Protein Response (UPR), au cours de l'IR. Nous avons étudié la cinétique d'activation et le rôle de chacune des voies de l'UPR – IRE1α–XBP1, PERK-eIF2α-ATF4 et ATF6 – dans la survie des cellules endothéliales artérielles humaines soumises à différentes durées d'IR. Nous avons observé une activation successive des voies PERK-eIF2α-ATF4, ATF6 et IRE1α-XBP1 en fonction de la durée de l'ischémie froide. À l'aide de méthodes bioinformatiques, d'agents pharmacologiques et de techniques d'extinction génique post-transcriptionnelle (siRNA) nous avons observé que la voie ATF6 était délétère, que la voie PERK-eIF2α-ATF4 était protectrice lorsqu'elle était maintenue activée durant l'ischémie et que la voie IRE1α-XBP1 avait un rôle dual. Par extrapolation à la clinique, nos résultats indiquent que l'UPR est une voie d'intérêt thérapeutique pour optimiser la survie des greffons ainsi que la qualité de vie des patients et que ses médiateurs pourraient permettre d'estimer la qualité du greffon lors de la transplantation.