UPThèses

La télangiectasie hémorragique héréditaire (HHT) est une maladie rare (1/10.000). Son incidence est plus élevée (pouvant atteindre 1/1000) dans certaines zones géographiques dont la région Poitou-Charentes. Cette maladie autosomique dominante est causée par des mutations d'un des trois gènes identifiés ENG, ACVRL1 et SMAD4 codant pour des protéines de la voie BMP spécifiquement exprimés dans les cellules endothéliales. Le nombre croissant de mutations détectées chez les patients et l'expressivité variable de certaines mutations nous a ammené à déterminer les conséquences de mutations afin d'établir une corrélation génotype/phénotype. Cette corrélation est importante pour le conseil génétique et évidemment le diagnostic prénatal. Dans ce contexte, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations. L'effet délétère de ces mutations sur la protéine et/ou l'épissage de l'ARN a été évalué. Nous avons montré que sur les 23 mutations d'ACVRL1 : 1) 18 mutations faux-sens affectent la fonctionnalité de la protéine en réponse à BMP9 et 3 mutations sont de simples polymorphismes, 2) la mutation exonique c.733A>G (p.Ile245Val) affecte l'épissage de l'exon 6, 3) La mutation c.1048+5G>A de l'intron 7 en dehors du site consensus induit un épissage aberrant de l'exon 7. En ce qui concerne l'ENG, nous avons analysé 4 mutations et nous avons montré que la mutation c.1088G>A (p.Cys363Tyr) a un impact sur l'activité du récepteur et que les mutations c.1134G>A (p.Ala378Ala) et c.1060C>T (p.Leu364Leu) altèrent l'épissage de l'exon 8. Ce travail montre l'importance de l'étude approfondie de toute nouvelle mutation par des études in silico, in vitro et in cellulo à différents niveaux cellulaires. Des études in vivo ultérieures peuvent compléter et appuyer la stratégie expérimentale que nous avons suivie.

En préservation-transplantation rénale, l’ischémie-reperfusion (IR) induit inflammation, fibrose, dysfonction et perte du greffon. Les événements d’IR sont de mieux en mieux identifiés, mais leurs complexité limite prédiction et thérapeutique. A partir d’une analyse bibliographique détaillée, nous proposons un modèle par agents de la réponse rénale aux lésions d’IR au niveau cellulaire/tissulaire, réalisé avec l'outil de modélisation NetLogo. Dans un premier temps, nous développons un modèle dynamique de l’oxygénation du cortex rénal, avec apport et diffusion de l’oxygène (O2), et consommation dépendant de la filtration. Nous adaptons ce modèle à l’état stationnaire pour l’O2, puis nous couplons les niveaux de PO2 à l'état énergétique (ATP) des cellules épithéliales et endothéliales (avec voies aérobie et anaérobie). Le statut de viabilité cellulaire est lié au niveau d'ATP, aboutissant à une représentation semi-phénoménologique de la réparation/survie vs apoptose/nécrose. Enfin, nous explorons le destin cellulaire et tissulaire lors d’IR simulées, avec l’ajout progressif d’éléments clefs de l’inflammation (invasion tissulaire par leucocytes, signaux lésionnels, phagocytose) et de la fibrose (fibroblastes, collagène). L’évolution du modèle vers la résolution de l’inflammation/régénération du tissu ou vers la fibrose tissulaire est observée selon les conditions imposées (durée/intensité, ischémie vs hypoxémie). Cette construction constitue le premier modèle des effets de l’oxygénation sur la dynamique cellulaire-tissulaire de l’inflammation-fibrose rénale en réponse à l’IR. A terme, elle permettra d'aborder clinique et thérapeutique de la conservation-transplantation rénale.

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs.

La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresser vers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à la dégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisation.

La pénurie d'organes a amené les équipes de transplantation à élargir l'acceptation des greffons à des organes provenant de donneurs marginaux. Le recours aux greffons marginaux impose de réduire les lésions induites durant l'IR, et doit conduire à une prise en charge optimisée de façon à limiter le risque de PNF et de RRF. C'est face à cette situation, que la question de la perfusion d'organe et de l'utilisation des machines de perfusion s'est posée et a justifié la réalisation de ce travail. Un modèle d'autotransplantation chez le porc a été choisi car il permet d'évaluer les effets de l'IR sur le rein. Les reins ont subi une ischémie contrôlée. La conservation des reins a été randomisée soit en incubation statique dans IGL-1 ou Belzer MPS soit sur machine de perfusion. Nous avons utilisé comme paramètre d'étude : la survie des animaux, différents dosages biologiques, une analyse histologique et une évaluation immunologique par RTqPCR des certains gènes impliqués dans le mécanisme lésionnel d'IR. Nos résultats montrent au total : -Que la machine de perfusion RM3 diminue le risque de RRF et PNF post greffe. -La supériorité de l'IGL-1 sur le Belzer MPS ; il existe un effet propre de la solution IGL-1 pour moduler les mécanismes inflammatoires et immunologiques liés aux lésions d'IR. -Que la reprise de fonction et la PNF dépendent du liquide utilisé et qu'il existe un effet d'addition entre l'IGL-1 et la machine de perfusion.

Les chimères Bcr-Abl sont dues à une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22, entrainant la fusion des gènes bcr et abl. La seule différence structurale entre p190bcr﷓abl, associé avec la Leucémie Aigue Lymphoblastique, et p210bcr-abl, responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique, réside dans le domaine DH/PH présent uniquement dans p210bcr-abl. Nous avons montré précédemment que Rac1 était activée dans les cellules exprimant p190bcr-abl et p210bcr-abl alors que RhoA n'est activé que dans les cellules exprimant p210bcr-abl (Harnois et al., Oncogene, 2003). Les cellules Ba/F3 parentales ne sont pas spontanément mobiles contrairement aux cellules Ba/F3p210 and Ba/F3p190. Les cellules exprimant p210bcr-abl présentent des mouvements amoeboïdes typiques alors que les cellules exprimant p190bcr-abl utilisent une mobilité de type roulement (rolling-type). Les résultats obtenus en utilisant des mutants des domaines GEF de Vav ou p210bcr-abl nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Vav, en complexe avec Bcr-Abl, est responsable à travers l'activation de Rac1 du déclenchement de la motilité des cellules exprimant Bcr-Abl. Le GEF de p210bcr-abl, spécifique de l'activation de RhoA, est indispensable pour la formation des mouvements amoeboïdes dans les cellules Ba/F3, mais ne joue pas de rôle dans le déclenchement de la mobilité spontanée de ces cellules (Daubon et al., Oncogene, 2008). Nous avons ensuite caractérisé une voie passant par Rac1/PAK1/LIMK1/cofiline1 dans laquelle chaque élément est essentiel pour le déclenchement de la motilité dite rolling-type. Nous avons montré que la voie classique RhoA/ROCK/MLC était seulement partiellement impliquée dans l'induction de la motilité amoeboïde dans les cellules Ba/F3p210. De façon surprenante, nous avons trouvé que RhoA et ROCK1 induisent l'activation de l'isoforme ADF/destrine de la famille des " Actin Depolymerizing Factors ", à travers la régulation négative de la LIMK2 au niveau transcriptionnel mais aussi par une dégradation protéasome-dépendante. Cette voie de signalisation originale permet une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires menant aux mouvements amoeboïdes en 3 dimensions.

Actuellement les transplanteurs sont confrontés à une pénurie de greffons, conduisant à l'élargissement des critères de choix des donneurs. Cette démographie fait place à des greffons plus sensibles aux lésions d'ischémie-reperfusion (I/R). Ces lésions conduisent à des dysfonctions de reprises de fonction des greffons, et participent à l'augmentation de l'immunogénicité du greffon et à l'emergence de rejets aigus et chroniques. Dans un premier temps, il est donc nécessaire de limiter les lésions d'I/R et conserver l'intégrité du greffon. Dans un deuxième temps, il est important de réduire l'immunogénicité du greffon et de contrôler le rejet de greffe tout en maintenant le receveur immunocompétent. Afin de limiter les lésions d'I/R nous avons évalué la solution de préservation SCOT de type extracellulaire contenant 30g/L de PEG 20kDa, dans un modèle murin d'isolement et de transplantation d'îlots pancréatiques. L'amélioration des conditions de conservation a permit de préserver l'intégrité des îlots et de réduire l'immunogénicité du greffon, et ce due aux propriétés immunoprotectrices des PEG 20kDa (effets obtenus pour 10 à 30g/L). Dans ce même modèle notre second objectif était d'établir un état de tolérance périphérique par déplétion transitoire des lymphocytes T alloréactifs. La déplétion des lymphocytes T en division a été induite au moment de l'allotransplantation des îlots, par administration transitoire d'un analogue nucleosidique inductible. La déplétion transitoire a permit d'aboutir à une immunotolérance dominante via l'émergence de lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+FoxP3+, cellules ouvrant de nouvelles perspectives dans l'inhibition des rejets d'allogreffes.

Afin de mieux comprendre le mécanisme physiopathologique et inflammatoire impliqué dans la fièvre Méditerranéenne familiale (FMF), nous avons étudié le profil cytokinique ex vivo monocytaire et lymphocytaire des patients FMF. Nous avons ensuite étudié l’implication potentielle dans la FMF de la protéine RAC1, qui semble jouer un rôle dans la production de l’IL-1β, d’une part, et dans la production du stress oxydant, d’autre part. Enfin, nous avons recherché une association potentielle entre les gènes IL-1β et IL-1RA et la susceptibilité et/ou la sévérité de la maladie. La première partie de l’étude a porté sur 34 patients FMF génétiquement confirmés, dont 9 ont été prélevés à deux reprises, en crise et hors crise, et 24 sujets sains. Les marqueurs inflammatoires MBL et CRP ont été dosés dans le sérum par ELISA, et les cytokines ont été quantifiées par Luminex dans le sérum et les surnageants de culture de PBMC de patients et des contrôles avec ou sans stimulation des monocytes par LPS et des lymphocytes par anti-CD3/CD28. Dans la deuxième partie de ce travail, une étude comparative des niveaux d’expression du gène RAC1 chez les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles a été effectuée par PCR quantitative en temps réel. L’IL-1β et l’IL-6 ont été dosées par ELISA en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1 dans les surnageants de culture de PBMC, avec ou sans stimulation par LPS. La quantification des marqueurs du stress oxydant a été effectuée dans le plasma ainsi que dans les surnageants de culture de PMN stimulés ou non par LPS, en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1. Les génotypes au niveau des 3 polymorphismes à la position -511, -31 et +3954 d

Il est prouvé que la conservation des greffons rénaux marginaux en machine de perfusion (MP) est bénéfique. Cependant, cette méthode nécessite des améliorations afin de minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion (I/R), par l’ajout d’oxygène et/ou d’un transporteur d’oxygène. Nous avons cherché à évaluer les effets de l’oxygénation et de l’ajout d’une hémoglobine de ver marin (HbAm, M101) durant la perfusion rénale hypothermique avant transplantation. Nos critères de jugement étaient basés sur la reprise de fonction du greffon et sur les lésions tardives de dysfonction rénale. Nous avons utilisé un modèle porcin : les reins ont été exposés à 1h d’ischémie chaude, puis perfusés dans une MP WAVES® pendant 23h à 4°C avant autotransplantation. Quatre groupes ont étudié : W (MP-21% O2), W-O2 (MP-100% O2), W-M101 (MP-21% O2 + 2g/L HbAm), W-O2+M101 (100% O2 + 2g/L HbAm), (n=6 per groupe). Les reins du groupe W-M101 ont montré un débit de perfusion plus élevé et une résistance rénale plus faible comparé aux autres groupes. Pendant la première semaine post-transplantation, les groupes W-O2 et W-M101 ont montré une créatininémie significativement plus faible et un meilleur taux de filtration glomérulaire (GFR). Les niveaux circulants de KIM-1 et IL-18 étaient plus faibles dans le groupe W-M101, tandis que les niveaux de NGAL et d’ASAT étaient plus faibles dans les groupes d’oxygénation active. Trois mois post-transplantation, la fraction excrétée de sodium et le ratio protéinurie/créatininurie étaient plus élevé dans le groupe W. La créatininémie était plus faible dans le groupe W-M101. La fibrose interstitielle a évalué à 3 mois post-transplantation étaient plus faible dans les groupes W-M101 et W-O2+M101. Nous avons révélé histologiquement que l’infiltration de mastocytes était significativement élevée dans le groupe W comparé aux autres groupes. Nous avons montré que la combinaison de 21% O2 + hémoglobine améliorent la reprise de fonction du greffon rénale.

L'ischémie-reperfusion (IR) est un syndrome associant un arrêt de la perfusion sanguine suivie de son rétablissement au sein d'un organe. L'IR est rencontrée dans de nombreuses pathologies telles que le syndrome coronarien aigu, la chirurgie vasculaire mais également durant la transplantation d'organes solides au moment de la préservation de l'organe. L'ischémie entraîne de nombreux désordres métaboliques générant un stress cellulaire parmi lequel deux organelles sont particulièrement touchées : la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE). Notre projet de recherche visait à comprendre l'impact du stress du RE et de sa réponse, appelée Unfolded Protein Response (UPR), au cours de l'IR. Nous avons étudié la cinétique d'activation et le rôle de chacune des voies de l'UPR – IRE1α–XBP1, PERK-eIF2α-ATF4 et ATF6 – dans la survie des cellules endothéliales artérielles humaines soumises à différentes durées d'IR. Nous avons observé une activation successive des voies PERK-eIF2α-ATF4, ATF6 et IRE1α-XBP1 en fonction de la durée de l'ischémie froide. À l'aide de méthodes bioinformatiques, d'agents pharmacologiques et de techniques d'extinction génique post-transcriptionnelle (siRNA) nous avons observé que la voie ATF6 était délétère, que la voie PERK-eIF2α-ATF4 était protectrice lorsqu'elle était maintenue activée durant l'ischémie et que la voie IRE1α-XBP1 avait un rôle dual. Par extrapolation à la clinique, nos résultats indiquent que l'UPR est une voie d'intérêt thérapeutique pour optimiser la survie des greffons ainsi que la qualité de vie des patients et que ses médiateurs pourraient permettre d'estimer la qualité du greffon lors de la transplantation.