UPThèses

Le métabolisme énergétique est le principal facteur déterminant de la viabilité cellulaire. Les maladies présentent de nombreuses anomalies métaboliques et énergétiques. En effet, les cellules altérées proviennent de procédés exergoniques et émettent de la chaleur vers leur environnement proche. De nombreux processus irréversibles peuvent se produire en modifiant le taux de production d'entropie. Ce niveau représente une quantité thermodynamique qui mesure ces processus irréversibles. Le niveau d'entropie est augmenté par plusieurs anomalies métaboliques et thermodynamiques dans les tumeurs cérébrales, les processus inflammatoires et les maladies neurodégénératives. Les travaux de recherche de cette thèse ont démontré et mis en évidence l'existence d'une diaphonie entre la voie canonique WNT/beta-caténine et le PPAR gamma qui joue un rôle majeur dans la reprogrammation du métabolisme de l'énergie cellulaire entre la phosphorylation oxydative, la glycolyse aérobie et la glycolyse anaérobie, dont le point d'équilibre de cette diaphonie entre ces voies moléculaires varie selon les maladies. Ces maladies sont des structures dissipatives, qui échangent de l'énergie ou de la matière avec leur environnement. Ce sont des systèmes ouverts, loin de l'équilibre thermodynamique qui opèrent sous un régime non linéaire évoluant vers des états non stationnaires. La thermodynamique loin de l'équilibre est une notion axée sur les rythmes circadiens. En effet, les rythmes circadiens participent directement à la régulation de cette diaphonie étudiée. Celle-ci représente une cible innovante dans le cadre l'imagerie moléculaire pour le diagnostic positif et différentiel de ces maladies.

L'émergence rapide de bactéries résistantes et l’absence de nouveaux traitements efficaces ont conduit à réutiliser d’anciens antibiotiques. Le chloramphenicol (CHL) et le thiamphenicol (THA) ont ainsi été proposés pour traiter les infections respiratoires multirésistantes. Leur administration directe dans les poumons sous forme d’aérosols thérapeutiques devrait augmenter leur efficacité et minimiser l’exposition systémique responsable d’effets secondaires, en particulier lors de traitements prolongés. Ce travail de thèse a eu pour objectifs de réaliser des étudies biopharmaceutiques et de développer des formulations d’aérosols pour la voie pulmonaire. La perméabilité membranaire du CHL et du THA a été évaluée sur le modèle d’épithélium bronchique Calu-3 et leur pharmacocinétique a été réalisée chez le rat après administrations intratrachéale et intraveineuse. La perméabilité membranaire in vitro du CHL s’est révélée élevée, et intermédiaire pour le THA. Les deux antibiotiques sont substrats de transporteurs membranaires d’efflux. Les études pharmacocinétiques, cohérents avec les études in vitro, ont montré un impact nul de la voie d’administration dans cas du CHL et modéré dans le cas du THA. Par conséquent, pour prolonger l’exposition pulmonaire à ces antibiotiques, des formulations à libération prolongées basées sur des nanoparticules ont été incluses dans des poudres sèches de microsphères pour inhalation. Ces poudres se caractérisent par une teneur optimale, des propriétés aérodynamiques satisfaisantes et un profil de libération prolongée, et sont donc prometteuses pour l’administration pulmonaire de CHL ou de THA sous la forme d’aérosols.

La colistine est un vieil antibiotique, utilisé à la fois en médecine humaine et vétérinaire. Cependant, l'arsenal antibiotique étant de plus en plus limité, la colistine apparait comme un des derniers remparts dans la lutte contre les bactéries multi-résistantes chez l'Homme. Afin de préserver l'efficacité de la colistine, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse : (i) les risques de sélection de résistance à la colistine en lien avec la découverte fin 2015 d'un gène porté par un plasmide (mcr-1). Ainsi, l'impact de l'usage de colistine par voie orale en production porcine a été évalué in vivo et une absence de sélection a été observée dans nos conditions expérimentales. De façon similaire, l'usage (minoritaire) de colistine en médecine humaine comme prophylaxie de décontamination digestive sélective (SDD) a été étudié chez des rats hébergeant un microbiote intestinal humain. Les résultats préliminaires ne montrent pas non plus d'effet de sélection. (ii) le développement d'un modèle pharmacocinétique basé sur la physiologie (PBPK) chez le porc pour l'usage par voie systémique de la colistine et de sa prodrogue, le colistine méthanesulfonate (CMS). Ce modèle a permis d'explorer la distribution tissulaire du CMS et de la colistine, notamment au niveau rénal où la toxicité est la plus fréquente. Comme application de ce modèle, l'estimation des temps d'attente avant abattage lors d'usage de CMS chez le porc a été effectué. Enfin, la capacité des modèles PBPK à réaliser des extrapolations intra et inter-espèces a été utilisé pour adapter ce modèle chez l'adulte et l'enfant, afin de pouvoir prédire les concentrations plasmatiques de colistine lors d'un traitement.

L'objectif de cette thèse était de développer et de caractériser un modèle de cellules souches cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire. Après avoir sélectionné et caractérisé une population de cellules souches d'origine mésenchymateuse, isolée à partir d'auricules humaines, exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d'immuno-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1. la caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs de la signalisation calcique et 2. l'étude de leur différenciation in vitro en parallèle à l'activité calcique intracellulaire. Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker. Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, Kv, NCX, s'expriment durant la différenciation. L'enregistrement de l'activité calcique (via une sonde optogénétique) montre la présence d'oscillations calciques qui évoluent en fréquence et en intensité pendant la différenciation. Les stocks-IP3 sensibles et l'échangeur NCX joueraient un rôle fondamental. Nous avons ensuite étudié l'importance du canal BKCa et des récepteurs sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+. L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-renouvellement mais n'affecte pas la migration. Quant à la S1P elle freine la prolifération et l'auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3. Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque.

La réduction des inégalités d'accès aux soins a toujours été un axe majeur des politiques de lutte contre le cancer. Alors qu'il existe de nombreuses études en cancérologie solide, peu d'études avec une méthodologie correcte existent en onco-hématologie, notamment chez les patients atteints de Myélome Multiple (MM). Cette maladie a vu son pronostic transformé par l'arrivée de nouvelles thérapeutiques dont l'usage a été rapidement intégré dans les recommandations de la Société Française d'Hématologie. L'objectif de travail intitulé Parcours de Soins des patients atteints d'hémopathie maligne en Poitou Charentes était donc de décrire et d'analyser les écarts aux recommandations, en prenant le MM comme premier exemple. Grâce au registre des Cancers Poitou-Charentes et à l'exhaustivité des cas qu'il assure, notre travail a permis de déterminer des variables associées à une inégalité d'accès aux soins. Ces variables sont démographiques (âge, distance entre le domicile et l'hôpital), liées à la tumeur (maladie symptomatique ou non), mais aussi organisationnelles (niveau de l'hôpital, passage en réunion de concertation pluridisciplinaire). De plus nous avons pu montrer que ces inégalités avaient un impact sur la survie globale des patients, notamment chez les plus âgés. Notre travail se poursuit par une analyse plus fine de la survie globale et l'étude des longs survivants du Myélome Multiple. A plus long terme, nous souhaitons appliquer cette approche à d'autres hémopathies.

Le syndrome d'ischémie-reperfusion (IR), inhérent à la transplantation rénale, est caractérisé par un infiltrat leucocytaire important et des lésions tissulaires graves dont les signaux initiateurs restent à ce jour peu décrits. Postulant que la libération d'alarmines par les cellules en nécrose est décisive dans ce processus, l'objectif principal du présent travail a été d'étudier la contribution de l'alarmine IL-33 dans la genèse des lésions tissulaires dans un modèle murin d'IR rénale. Nos résultats montrent que l'IL-33 est rapidement libérée du rein après IR comme protéine circulante, dès une heure de reperfusion. Les souris IL-33gt/gt, déficientes en IL-33, sont moins sensibles aux lésions induites par l’IR, comme l'attestent le maintien de la fonction rénale et des lésions histologiques atténuées avec un recrutement de polynucléaires neutrophiles (PNN) diminué par rapport aux souris contrôles. Ceci est associé à la perte du recrutement de cellules iNKT productrices d'IFN-γ/IL-17A. Parallèlement, les souris Jα18KO, déficientes en cellules iNKT et protégées contre les lésions d'IR, possèdent également des niveaux élevés d'IL-33 circulante. Nous proposons donc que l'IL-33 endogène contribue aux lésions d'IR en favorisant le recrutement de cellules iNKT, conduisant ainsi à un recrutement amplifié de PNN au niveau du rein lésé. Notre étude, en identifiant l'alarmine IL-33 comme un médiateur précoce de la réponse immunitaire innée induite par l'IR rénale, mettant en jeu les cellules iNKT, contribue à la compréhension des mécanismes impliqués dans la genèse des lésions associées à la greffe rénale et permet de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

L'impulsivité, un trait multidimensionnel, détermine la sévérité d'affections comportant des désordres compulsifs (syndrome de Gilles de la Tourette, maladie de Parkinson, troubles obsessionnels compulsifs), mais la nature de la relation impulsivité / compulsivité reste méconnue. L'intérêt du présent travail est d'identifier les substrats neurobiologiques de la balance impulsivité / compulsivité, dans une approche transnosographique, en s'aidant au plan préclinique, de manipulations causales et au plan clinique, d'une approche corrélationnelle. Ainsi, nous démontrons pour la première fois en dehors du champ de l'addiction, non seulement que l'impulsivité motrice, endophénotype de vulnérabilité à la compulsivité, prédit, sous l'influence de la transmission noradrénergique, la transition vers la compulsivité, mais aussi que (dans le modèle de la maladie de Parkinson) la dénervation de la voie nigrostriée et les traitements substitutifs dopaminergiques amplifient l'état impulsif. D'où l'interaction complexe entre le trait impulsif, les traitements et le processus dégénératif. Enfin, nous démontrons le bénéfice thérapeutique de la stimulation de la portion antérieure du pallidum interne dans les formes sévères de tics et suggérons dans un modèle préclinique d'une grande valeur heuristique, que le trait impulsif prédit l'efficacité de la stimulation du core du noyau accumbens. Nos résultats démontrent l'intérêt de mieux caractériser le trait impulsif des patients présentant des désordres compulsifs (syndrome de Gilles de la Tourette, maladie de Parkinson) et ouvrent ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, tant pour la prévention de la transition de l'impulsivité à la compulsivité, que dans le traitement de ceux-ci.

Le psoriasis et la dermatite atopique sont des pathologies inflammatoires cutanées chroniques, fréquentes et invalidantes. Dans la peau des patients souffrant de ces pathologies, un dérèglement de la réponse immunitaire aboutissant à une inflammation chronique est toujours observé. Le réseau cytokinique joue un rôle essentiel dans la physiopathologie cutanée en permettant la communication entre les cellules cutanées et les cellules immunitaires. Dans le psoriasis et la dermatite atopique, ce réseau est largement perturbé. En effet, un grand nombre de cytokines proinflammatoires sont surexprimées au détriment des cytokines anti-inflammatoires. Cette inflammation chronique est directement responsable de l'apparition des lésions cutanées. Parmi les cytokines surexprimées dans ces pathologies, des études antérieures du LITEC ont montré in vitro que l'Oncostatine M (OSM) est impliquée dans la production de peptides antimicrobiens et de médiateurs de l'inflammation, ainsi que dans l'inhibition de la différenciation des kératinocytes. Notre objectif était de poursuivre ces travaux en étudiant le rôle de l'OSM dans l'inflammation cutanée in vitro et in vivo chez la souris. Nous avons pour cela, comparé le rôle de l'OSM à celui d'autres cytokines de la famille de l'IL-6, l'IL-6 et l'IL-31, qui présentent également une activité sur le kératinocyte. L'activité de ces cytokines a été étudiée in vitro sur des cultures primaires de kératinocytes murins en monocouche, sur des épidermes reconstruits murins ainsi qu'in vivo dans différents modèles d'inflammation cutanée. Nous montrons que l'OSM est plus active que l'IL-6 et l'IL-31 sur les kératinocytes en culture et que la surexpression de cette cytokine in vivo dans la peau de souris à l'aide d'adénovirus recombinants induit une inflammation cutanée forte, présentant des caractéristiques communes avec le psoriasis et la dermatite atopique. Néanmoins, les souris déficientes pour le gène codant l'OSM ne présente aucune diminution du phénotype inflammatoire cutané dans le modèle de psoriasis induit par application d'Imiquimod et dans un modèle de dermatite atopique induit par application de Calcipotriol, suggérant l'existence de mécanismes de compensation par d'autres cytokines proinflammatoires. En parallèle de cette étude, nous avons mis au point un nouveau modèle d'épidermes reconstruits murins permettant l'étude de l'activité des cytokines sur les kératinocytes. Ce modèle présente l'avantage de reproduire plus finement la physiologie d'un épiderme normal par rapport aux autres modèles préalablement décrits et ouvre la perspective de développer des épidermes reconstruits à partir de kératinocytes de souris transgéniques. En conclusion, ces travaux démontrent le rôle pro-inflammatoire de l’OSM dans l'inflammation cutanée et son activité majeure sur les kératinocytes en comparaison à celles décrites pour l'IL-6 et l'IL-31. Néanmoins, la pertinence du ciblage thérapeutique de cette cytokine dans le psoriasis et la dermatite atopique reste encore à démontrer.

Le but de ce travail est d'élaborer et d'évaluer une intervention de santé publique, visant à augmenter la participation au dépistage ciblé par coloscopie de la population à risque plus élevé de cancer colorectal (CCR) en raison d'antécédents familiaux en faisant appel à une méthodologie qui repose sur 3 étapes successives : 1- une étude observationnelle : l'identification des déterminants associés à la réalisation de la coloscopie chez la fratrie d'un patient atteint de CCR avant 60 ans. (3 publications) 2- une expérimentation contrôlée, visant à tester l'efficacité d'une intervention personnalisée, par une infirmière de prévention, sur la participation au dépistage des fratries d'un patient atteint de CCR ou d'adénome avant 60 ans. L'intervention personnalisée qui a intégré non seulement les fratries mais également les cas index et les médecins a fait la preuve d'une efficacité jusque là jamais atteinte dans les études menées antérieurement aux USA, qui ciblaient uniquement les fratries. Cette analyse épidémiologique a été enrichie par des analyses linguistiques et sociologiques afin de mieux comprendre l'impact de cette intervention téléphonique. (1 publication) 3- Cependant, les contraintes propres à la conduite d’un essai interventionnel randomisé, si elles garantissent un niveau de preuve élevé du bénéfice de l’intervention, ont aussi pour conséquence un caractère expérimental ; cet essai ne pourra être généralisé à l'identique. Une étude de recherche interventionnelle en santé des populations a été soumise à l'appel à projets 2016 de l'INCa.

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs.