UPThèses

L’antibiorésistance est un phénomène décrit depuis la découverte des premiers antibiotiques. Cependant, leur utilisation déraisonnée, à la fois en santé humain et vétérinaire, a favorisé l’émergence et l’installation de mécanismes de résistance à de nombreuses classes d’antibiotiques, dont les bêta-lactamines. Cette classe constitue le traitement de référence des infections à bacilles Gram-négatifs, comme Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. De nouvelles bêta-lactamines, comme l’association ceftolozane/tazobactam, ceftazidime/avibactam ou encore le cefiderocol, ont été développées pour être efficace sur les bactéries multi-résistantes. L’émergence de mécanismes de résistance spécifiques à ces molécules a malheureusement été décrite lors de leur utilisation clinique. De plus, de nombreux outils de diagnostics, comme le séquençage du génome entier, permettent d’identifier le ou les mécanismes potentiellement responsables de la résistance. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’utiliser des approches complémentaire de microbiologie, incluant de la biologie moléculaire, à des méthodes de modélisation de données, afin de caractériser des mutations responsables de résistance aux nouvelles bêta-lactamines. Dans une première partie, un couple de P. aeruginosa, initialement sensible au ceftolozane/tazobactam, puis devenu résistant sous traitement par cette association, a été spécifiquement étudié. Les mutations probablement responsables de la résistance ont été identifiées par séquençage génome entier (AmpC:p.G183D et AmpD:p.H157Y), puis reproduites dans une souche de référence (PAO1). Les données expérimentales ont montré une décorrélation entre les mesures de concentration minimal inhibitrice (CMI) et les résultats de courbes de bactéricidie (TKC). La modélisation semi-mécanistique pharmacocinétique/pharmacodynamique a permis de décrire de façon précise l’impact de chaque mutation, en incluant la contribution dans la résistance acquise (effet immédiat) et la résistance adaptative. Les outils utilisés lors de cette première partie ont permis l’obtention de résultats sur la sensibilité à l’imipénème et au ceftazidime/avibactam. Ces données sont importantes pour comprendre l’effet de mutations individuelles et associées sur la sensibilité aux antibiotiques, notamment dans le cadre du développement des antibiogrammes in silico. Dans une seconde partie, la résistance au cefiderocol apparue dans des souches cliniques de K. pneumoniae a été investiguée grâce à la mise en place de méthodes de séquençage de troisième génération au sein du laboratoire. La description de tous les mécanismes de résistance déjà présents a pu être réalisée, et une nouvelle mutation dans le gène fiu, jamais identifiée dans une souche clinique, a pu être mise en évidence.

L’antibiorésistance, phénomène qui caractérise la capacité des bactéries à résister aux antibiotiques, constitue l’une des plus graves menaces de santé publique selon l’Organisation Mondiale de la Santé. En effet, les infections dues aux bactéries multi-résistantes pourrait devenir la principale cause de mortalité à l’horizon 2050. Afin de maintenir l’efficacité des traitements actuels et pour lutter contre l’émergence de nouvelles résistances, les antibiotiques sont de plus en plus utilisés en combinaison. Dans ce contexte, la modélisation PKPD permet d‘étudier, de développer et d’optimiser les traitements antibiotiques. Ce travail de thèse vise à démontrer l’intérêt de cet outil dans l’étude des combinaisons d’antibiotiques, au travers de deux études : 1. Une étude de développement d’un design optimisé de checkerboard, permettant de caractériser les combinaisons d’antibiotiques. Dans cette étude, il a été montré que le design rhombique permettait caractériser efficacement les interactions PD entre antibiotiques utilisés en combinaison, tout en réduisant considérablement la charge de travail expérimental. Le design proposé était particulièrement adapté aux études de screening des combinaisons d’antibiotiques. 2. Une étude de l’interaction PD entre la ceftazidime/avibactam et la colistine contre quatre souches cliniques de Klebsiella pneumoniae multi-résistantes. Dans cette étude, des expériences de time-kill in vitro ont été réalisées avec la ceftazidime/avibactam et la colistine seul et en combinaison, et l’interaction entre ces molécules a été caractérisée au cours du temps à l’aide d’une approche de modélisation PKPD.

Du fait du manque de nouveaux antibiotiques et de l’augmentation des résistances, il est important de comprendre les mécanismes et la dynamique de ces phénomènes. La modification du lipopolysaccharide (LPS) est le principal mécanisme contribuant à la résistance des bactéries aux polymyxines. Le plasmide portant le gène MCR-1 (Mobile Colistin Resistance) retrouvé chez Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae code une phosphoethanolamine transférase capable de modifier le LPS par une addition de phosphoethanolamine sur le lipide A du LPS alors que chez Acinetobacter baumannii résistant aux polymyxines il a été décrit à la fois des modifications du LPS par une phosphoethanolamine et une perte du LPS. Cependant, les interactions entre les différents mécanismes exprimés par ces bactéries à Gram-négatif pour devenir résistantes à la colistine et à la polymyxine B sont encore peu décrit. Les courbes de bactéricidies séquentielles ont étés utilisées comme une approche alternative pour discriminer l’héterorésistance de la population bactérienne (2 sous populations S/R) d’une résistance adaptative (AR) durant le traitement par la colistine ou la polymyxine B. Au cours de ce travail de thèse, nous avons: 1. Confirmé que l’approche des courbes de bactéricidies séquentielles peut discriminer deux modèles pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) semi-mécanistiques décrivant soit une population stable héterorésitante (S/R) soit une population bactérienne instable et homogène dont la résistance s’adapte au cours du temps (AR). 2. Déterminé l’impact de la présence du plasmide MCR-1 sur les mécanismes de résistance chromosomique impliqués dans la résistance adaptative de E. coli and K. pneumoniae aux polymyxines. 3. Déterminé les mécanismes impliqués dans la résistance aux polymyxines dans deux souches cliniques d’A. baumannii, isolées avant et après traitement d’un patient à la colistine. Dans ce travail, une nouvelle approche de courbes de bactéricidies séquentielles a été utilisée et validée afin de pouvoir différencier différents modèles PK/PD semi-mécanistiques. De plus, ce travail a montré que la présence du plasmide MCR-1 favorisait l’activation d’autres mécanismes chromosomiques conduisant à de hauts niveaux de résistances aux polymyxines. Enfin, la polymyxine B montrait une plus faible capacité à induire ces mécanismes chromosomiques conduisant à de hauts niveaux de résistance.

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie non-tuberculeuse responsable d’infections pulmonaires difficiles à traiter en clinique. Le traitement actuellement recommandé est associé à un taux d’échec élevé et à l'émergence de résistances à la plupart des antibiotiques. Dans le contexte actuel, avec un faible nombre de nouveaux antibiotiques mis sur le marché, il est important de d’optimiser l’utilisation des antibiotiques à notre disposition par des approches pharmacocinétique/pharmacodynamiques (PK/PD). Dans les infections pulmonaires, l'administration directe de médicaments à faible perméabilité tels que la céfoxitine (FOX) et l'amikacine (AMK) dans les poumons sous forme d'aérosols devrait accroître leur efficacité au site d’infection tout en diminuant la toxicité systémique responsable des effets indésirables, particulièrement dans le cas des traitements prolongés. De plus, l'utilisation d'antibiotiques en combinaison pourrait réduire le risque de développement de résistance. Plusieurs points ont été abordés dans cette thèse : 1. Études biopharmaceutiques sur AMK et FOX : Il a été démontré qu'après la nébulisation d'AMK et de FOX, les concentrations pulmonaires étaient presque 1000 fois plus élevées qu'après l'administration intraveineuse des deux antibiotiques, ce qui en fait de bons candidats pour la nébulisation. 2. Étude PK/PD de céfoxitine : un modèle PK/PD semi-mécanique a été mis au point à partir de données pharmacocinétiques in vitro, permettant d'identifier les relations concentration-effet pour deux sous-populations de bactéries tout en tenant compte de la dégradation de la céfoxitine. 3. Étude pharmacocinétique et pharmacodynamique de la bi-combinaison : à l'aide d'un modèle mathématique basé sur un mécanisme et de données obtenues à partir données in vitro, il a été démontré que l'effet combiné d'AMK et de FOX était additif et/ou synergique selon les différentes concentrations. 4. Bi- ou tri-combinaisons : plusieurs tri-combinaisons incluant AMK, FOX et un 3ème antibiotique (incluant clarithromycine, linézolide, clofazimine, ciprofloxacine, moxifloxacine, rifampicine et rifabutine) ont été testés contre une souche de référence, un isolat clinique résistant à la clarithromycine (Ma1611) et un isolat clinique multirésistant (T28). Toutes les tri-combinaisons étaient actives contre la souche de référence. Les combinaisons étaient également actives sur la souche Ma1611 sauf pour les associations avec la clofazimine et la clarithromycine. Aucune combinaison n'était active contre T28. Les bi-combinaisons avec de plus fortes concentrations de FOX et les fluoroquinolones ou les rifamycines étaient efficaces contre T28. Cela suggère une optimisation du schéma thérapeutique pour le traitement des infections pulmonaires à M. abscessus. 5. La tri-combinaison comprenant AMK, FOX et moxifloxacine (MXF) jusqu'à 21 jours contre un isolat clinique résistant à la clarithromycine Ma1611 n'a montré aucun effet supplémentaire de l'utilisation de MXF car la tri-combinaison n'était pas plus efficace que la bi-combinaison d'AMK et FOX.

La lutte contre les bactéries multirésistantes est une priorité majeure définie par l’Organisation Mondiale de la Santé, puisque les dernières prédictions estiment que les infections par des bactéries multirésistantes feront plus de morts que le cancer d’ici 2050. Dans le contexte actuel, avec un faible nombre de nouveaux antibiotiques mis sur le marché pour lutter contre les bactéries multirésistantes, il est important de d’optimiser l’utilisation des antibiotiques à notre disposition. C’est dans ce but que les modèles semi-mécanistiques servant à analyser les résultats d’études de PK/PD des antibiotiques peuvent être développés. Ces outils mathématiques permettent de quantifier les relations concentration-effet, de molécules seules ou de combinaisons de molécules afin d’optimiser leur efficacité, prévenir les résistances et donc prolonger la durée de vie des antibiotiques. Dans ce travail, après une présentation des méthodes d’étude de la PK/PD des antibiotiques seuls et en combinaison, les résultats de deux projets sont présentés : 1. Une étude de la PK/PD de la céfoxitine contre une souche de Mycobacterium abscessus. Dans une première partie, il a été montré que l’administration de la céfoxitine par nébulisation permet d’obtenir des concentrations pulmonaires 1000 fois plus importantes qu’après une administration intraveineuse, faisant de la céfoxitine un bon candidat à la nébulisation. Dans la seconde partie un modèle PK/PD semi-mécanistique a été développé à partir de données in vitro, ce qui permet d’identifier la relation concentration-effet pour deux sous-populations bactériennes tout en tenant compte de la dégradation de la molécule. 2. Une étude de la PK/PD de l’association polymyxine B et minocycline contre une souche d’Acinetobacter baumannii résistante à la polymyxine B. Cette étude in vitro comprend des données de bactéricidie avec suivi de la densité de bactéries résistantes à la polymyxine B, enrichies d’expériences complémentaires servant à préciser les caractéristiques de cette sous-population résistante. Ces données ont toutes été analysées par modélisation PK/PD semi-mécanistique, ce qui a notamment permis de quantifier l’importance de l’interaction entre les deux molécules et de formuler des hypothèses sur les mécanismes de cette interaction.