UPThèses

La lactation permet l’apport de nutriments et de cellules immunitaires essentielles au nouveau-né. Elle entraîne également le passage de xénobiotiques, tels que des médicaments ou des polluants de l’environnement, dans le lait. Bien que le passage des xénobiotiques dans le lait soit connu, aussi bien en médecine humaine (monitoring des femmes allaitantes) qu’en médecine vétérinaire (étude des résidus et du temps d’attente), ce phénomène complexe est peu étudié. Les travaux de la thèse se sont focalisés sur une étude cinétique comparative d’antibiotiques dans le lait de trois espèces animales de production (vache, chèvre, brebis). Quatre antibiotiques (spiramycine, oxytétracycline, marbofloxacine et amoxicilline) ont été sélectionnés en raison de leurs caractéristiques physico-chimiques et propriétés pharmacocinétiques distinctes, représentant ainsi un panel de différents profils cinétiques dans le lait. L’objectif de la thèse était d’étudier le passage de ces différentes molécules dans le lait de trois espèces animales. Pour répondre à cet objectif, la thèse s’est déroulée en trois grandes étapes : (i) La génération de nouvelles données expérimentales. Pour cela, chaque antibiotique a été administré par voie intramusculaire aux trois espèces et des prélèvements sanguins et laitiers individuels ont été réalisés pendant plusieurs jours suivant l’administration. (ii) Le développement et la validation de méthodes analytiques spécifiques à chaque antibiotique et chaque matrice (plasma et lait), suivi du dosage des prélèvements. L’utilisation de l’approche globale, basée sur le profil d’exactitude, a été illustrée en prenant l’exemple de la spiramycine. Grâce à cette approche, une seule et unique méthode de dosage a été développée pour le dosage de la spiramycine et de son métabolite actif dans le lait des vaches, chèvres et brebis, permettant ainsi de simplifier et d’accélérer les dosages en routine dans les trois laits. (iii) Le développement d’un modèle pharmacocinétique basé sur la physiologie (PBPK) générique pour décrire le passage de molécules dans le lait d’animaux de production. Une revue approfondie de la littérature a permis de regrouper les connaissances sur la physiologie des trois espèces animales, la sécrétion et la composition du lait ainsi que sur les données physico-chimiques et pharmacocinétiques des quatre molécules, nécessaires pour la construction du modèle. Des expérimentations in vitro sur la diffusion des molécules à travers une membrane physiologique ont été réalisées en collaboration avec l’Université d’Utrecht afin de renseigner les paramètres de perméabilité membranaire. Enfin, le modèle PBPK a été appliqué à la cinétique de l’oxytétracycline dans le lait de vache et de chèvre et a permis d’explorer la distribution de l’antibiotique dans la glande mammaire et le lait, son état d’ionisation ainsi que sa fixation aux composants du tissu et du lait et sa répartition entre la matière grasse et la phase aqueuse du lait. Des analyses non compartimentales ont été réalisées sur les trois autres antibiotiques, permettant de comparer leur excrétion dans le lait des trois espèces, en fonction de leur lipophilie, leur ionisation et leurs caractéristiques pharmacocinétiques plasmatiques. Ainsi, au-delà de l’évaluation du passage de ces quatre antibiotiques dans le lait, ce projet a pour ambition, grâce au modèle PBPK générique, d’aider à prédire la pharmacocinétique des xénobiotiques dans le lait des animaux, voire même des femmes allaitantes.

La maladie d’Alzheimer (MA) est actuellement considérée comme la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Son incidence est en nette augmentation, du fait du vieillissement croissant de la population et de traitements inefficaces. Elle touche aujourd’hui presque 50 millions de personnes dans le monde dont près de 1,2 millions de Français. Environ 225 000 nouveaux cas sont diagnostiqués en France chaque année, faisant de cette maladie neurodégénérative la quatrième cause de mortalité dans ce pays. Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif de la maladie. Les polyphénols naturels, décrits comme possédant de multiples propriétés, pourraient être des molécules candidates pour le traitement de la MA. En effet, elles ont notamment des activités anti-inflammatoires, inhibitrices de l’agrégation du peptide amyloïde et sont capables de le désagréger. Ainsi, le resvératrol, polyphénol de référence, a été largement étudié dans des modèles cellulaires et animaux ainsi que chez le patient atteint de la MA. Malheureusement, il est très rapidement métabolisé et doit donc être administré à de très fortes doses pour être efficace. La viniférine, dimère naturel du resvératrol extraite à partir des sarments de vigne, pourrait ainsi, de par sa structure chimique, présenter des effets bénéfiques supérieurs à ceux du resvératrol. Dans une étude antérieure réalisée au laboratoire sur un modèle de souris transgénique de la MA, les souris APPswePS1dE9, il a été montré que la viniférine, administrée de façon hebdomadaire par voie intrapéritonéale (i.p.), conduisait à une réduction de la taille et de la densité des dépôts amyloïdes ainsi que de la neuroinflammation dans le cerveau des souris. Cependant, ces effets bénéfiques n'ont pas été comparés à ceux du resvératrol. De plus, l’effet de la viniférine sur le déclin cognitif n'a pas été évalué. L’objectif de cette thèse était donc de comparer les éventuels effets préventifs et/ou curatifs de la viniférine et du resvératrol dans ce modèle murin de la MA sur les dépôts amyloïdes et la neuroinflammation, ainsi que sur le déclin cognitif. Dans une première étude, des souris APPswePS1dE9 ou sauvages ont été traitées par une injection i.p. hebdomadaire de viniférine ou de resvératrol à la dose de 20 mg/kg ou par leur véhicule, le polyéthylène glycol 200 (PEG 200) entre 7 et 11 mois, afin d’évaluer la capacité de ces polyphénols à ralentir l’évolution de la maladie. À 7 mois, les principales lésions caractéristiques de la MA sont déjà présentes chez ces souris. Dans une seconde étude, l’effet préventif des polyphénols injectés de 3 à 12 mois chez ces souris a été recherché (aucune lésion à 3 mois). Dans ces 2 études in vivo, l’évolution du statut cognitif des souris a été évaluée grâce au test comportemental de la piscine de Morris. La charge amyloïde, les dépôts amyloïdes et la neuroinflammation ont été quantifiés par western-blot, ELISA, immunofluorescence et TEP-scan. Les résultats ont montré que la viniférine diminuait le taux des formes insolubles d’Aβ42 et d’Aβ40 et les dépôts amyloïdes hippocampiques avec une meilleure efficacité que le resvératrol à 11 mois. De plus, les deux polyphénols ont prévenu partiellement le déclin cognitif. En revanche, ces polyphénols n’ont pas corrigé la neuroinflammation. Ce dernier résultat peut s’expliquer par l’effet pro-inflammatoire du PEG 200, inconnu jusqu’à présent, dans l’hippocampe des souris sauvages traitées par celui-ci. Le traitement par la viniférine de 3 à 12 mois induit aussi une diminution des dépôts amyloïdes. Toutefois, aucun effet sur le déclin mnésique et la neuroinflammation n’est observé. L’effet secondaire du PEG 200 peut masquer l’effet de la viniférine sur les processus inflammatoires et la perte mnésique. D’autres études sont nécessaires avec un autre véhicule ainsi qu’une analyse approfondie de la signature des oligomères pour juger réellement des effets de la viniférine sur la composante amyloïde dans la MA.

La lutte contre les bactéries multirésistantes est une priorité majeure définie par l’Organisation Mondiale de la Santé, puisque les dernières prédictions estiment que les infections par des bactéries multirésistantes feront plus de morts que le cancer d’ici 2050. Dans le contexte actuel, avec un faible nombre de nouveaux antibiotiques mis sur le marché pour lutter contre les bactéries multirésistantes, il est important de d’optimiser l’utilisation des antibiotiques à notre disposition. C’est dans ce but que les modèles semi-mécanistiques servant à analyser les résultats d’études de PK/PD des antibiotiques peuvent être développés. Ces outils mathématiques permettent de quantifier les relations concentration-effet, de molécules seules ou de combinaisons de molécules afin d’optimiser leur efficacité, prévenir les résistances et donc prolonger la durée de vie des antibiotiques. Dans ce travail, après une présentation des méthodes d’étude de la PK/PD des antibiotiques seuls et en combinaison, les résultats de deux projets sont présentés : 1. Une étude de la PK/PD de la céfoxitine contre une souche de Mycobacterium abscessus. Dans une première partie, il a été montré que l’administration de la céfoxitine par nébulisation permet d’obtenir des concentrations pulmonaires 1000 fois plus importantes qu’après une administration intraveineuse, faisant de la céfoxitine un bon candidat à la nébulisation. Dans la seconde partie un modèle PK/PD semi-mécanistique a été développé à partir de données in vitro, ce qui permet d’identifier la relation concentration-effet pour deux sous-populations bactériennes tout en tenant compte de la dégradation de la molécule. 2. Une étude de la PK/PD de l’association polymyxine B et minocycline contre une souche d’Acinetobacter baumannii résistante à la polymyxine B. Cette étude in vitro comprend des données de bactéricidie avec suivi de la densité de bactéries résistantes à la polymyxine B, enrichies d’expériences complémentaires servant à préciser les caractéristiques de cette sous-population résistante. Ces données ont toutes été analysées par modélisation PK/PD semi-mécanistique, ce qui a notamment permis de quantifier l’importance de l’interaction entre les deux molécules et de formuler des hypothèses sur les mécanismes de cette interaction.

Candida albicans et Cutibacterium acnes sont des pathogènes opportunistes ayant des co-localisations sur le corps humain. Du fait de leur aptitude commune à former des biofilms, ils peuvent coloniser de nombreux dispositifs médicaux. Ce mode biofilm confère aux microorganismes une résistance aux traitements conventionnels. Ainsi, la découverte de nouvelles molécules actives contre ces biofilms est nécessaire. Les végétaux constituent un réservoir de composés d'intérêt. Le framboisier, plante riche en polyphénols actifs et dont les activités antimicrobiennes et anti-biofilms bactériens ont précédemment été démontrées a donc été sélectionné pour cette étude. Un modèle de biofilm mixte impliquant la levure C. albicans et la bactérie C. acnes a été mis au point et les interactions entre ces espèces ont été caractérisées. C. albicans et C. acnes forment ensemble un biofilm polymicrobien. En conditions anaérobies, la croissance des biofilms mono- et polymicrobiens est comparable. En conditions aérobies, la présence des levures favorise la croissance précoce de C. acnes. C. albicans consommerait localement l'oxygène, rendant les conditions plus favorables à C. acnes. La présence de C. acnes dans le biofilm limite l’activité de la micafungine pourtant active contre les biofilms monoespèces de C. albicans. Concernant le framboisier, des extractions par solvants de polarité croissante ont été réalisées sur des tiges et des feuilles de framboisier, co-produits de culture. Les extraits hexaniques ont montré la plus forte activité anti-biofilm de C. albicans. Leur fractionnement bioguidé par ces mêmes tests a permis d'obtenir quatre sous-fractions enrichies en composés actifs.

L'augmentation des résistances aux antibiotiques ces dernières années et le faible nombre de nouveaux antibiotiques récemment approuvés ont suscité un intérêt considérable pour les associations médicamenteuses. Parmi celles-ci, les associations β-lactamine-inhibiteur de β-lactamases, comme l’aztréonam-avibactam (ATM-AVI), visent à surmonter la résistance due à la production de β-lactamases, l'un des principaux mécanismes de résistance chez les bactéries à Gram négatif. Cependant, les interactions PD entre molécules associées peuvent être complexes. Afin de mieux comprendre la PK/PD de l’ATM-AVI, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse : i. La PK de l’ATM-AVI au site infectieux. Une étude de microdialyse réalisée chez le rat avec ou sans péritonite a montré que la distribution de l’ATM-AVI dans le liquide péritonéal était rapide et que les concentrations au site infectieux pourraient être prédites à partir des concentrations sanguines. ii. L’interaction PD entre ATM et AVI. Des études de checkerboard analysées avec un modèle Emax ont permis de caractériser l’effet de l’AVI sur la CMI de l’ATM en termes d’efficacité et de puissance en présence de souches multi-résistantes. Pour compléter ces résultats, un modèle PK/PD a été développé à partir de données in vitro afin d’évaluer l’évolution de l’effet combiné de l’ATM-AVI au cours du temps et d’étudier la contribution individuelle de chacun des effets de l’AVI à l’activité combinée. Selon les résultats de cette modélisation, l’activité bactéricide de l’association serait principalement expliquée par l’effet potentialisateur de l’AVI et ce malgré sa capacité à prévenir la dégradation de l’ATM de manière efficace.

La colistine est un vieil antibiotique, utilisé à la fois en médecine humaine et vétérinaire. Cependant, l'arsenal antibiotique étant de plus en plus limité, la colistine apparait comme un des derniers remparts dans la lutte contre les bactéries multi-résistantes chez l'Homme. Afin de préserver l'efficacité de la colistine, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse : (i) les risques de sélection de résistance à la colistine en lien avec la découverte fin 2015 d'un gène porté par un plasmide (mcr-1). Ainsi, l'impact de l'usage de colistine par voie orale en production porcine a été évalué in vivo et une absence de sélection a été observée dans nos conditions expérimentales. De façon similaire, l'usage (minoritaire) de colistine en médecine humaine comme prophylaxie de décontamination digestive sélective (SDD) a été étudié chez des rats hébergeant un microbiote intestinal humain. Les résultats préliminaires ne montrent pas non plus d'effet de sélection. (ii) le développement d'un modèle pharmacocinétique basé sur la physiologie (PBPK) chez le porc pour l'usage par voie systémique de la colistine et de sa prodrogue, le colistine méthanesulfonate (CMS). Ce modèle a permis d'explorer la distribution tissulaire du CMS et de la colistine, notamment au niveau rénal où la toxicité est la plus fréquente. Comme application de ce modèle, l'estimation des temps d'attente avant abattage lors d'usage de CMS chez le porc a été effectué. Enfin, la capacité des modèles PBPK à réaliser des extrapolations intra et inter-espèces a été utilisé pour adapter ce modèle chez l'adulte et l'enfant, afin de pouvoir prédire les concentrations plasmatiques de colistine lors d'un traitement.