UPThèses

Le neuroblastome (NB) est un cancer pédiatrique dérivé de la crête neurale. Les NB à haut risque sont des tumeurs peu différenciées présentant une amplification de MYCN et les plus agressives possèdent en plus une mutation d'ALK. Pour améliorer le traitement de ces tumeurs, les nouvelles thérapies cherchent à induire la différenciation cellulaire, l'inhibition de MYCN et la réduction de la signalisation d'ALK. Les résultats obtenus indiquent que le VIP induit une neuritogenèse dans les cellules de NB à haut risque SK-N-DZ et Kelly, et réduit en plus l'expression de MYCN dans les cellules Kelly, comme précédemment observé pour les cellules IMR-32. En parallèle, le VIP diminue l'invasion des cellules Kelly et IMR-32 et réduit également l'activité d'AKT qui est impliquée dans la signalisation d'ALK, dans les cellules Kelly qui présentent la mutation ALK F1174L. Certains effets du VIP sont dépendants de la PKA. Des analogues du PACAP, un peptide apparenté au VIP, présentent une efficacité supérieure à celle du VIP dans les cellules Kelly. Les effets du VIP sur la neuritogenèse et l'expression de MYCN dans ces cellules sont médiés par le récepteur VPAC2 qui peut avoir une localisation nucléaire dans les lignées cellulaires et les cellules de patients atteints de NB. Une délocalisation de ce récepteur nucléaire par ses propres ligands est observée. De plus, des cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux induisent la différenciation des cellules de NB via les peptides VIP et/ou PACAP. L'ensemble de ces résultats indiquent que le VIP et des analogues du PACAP agissent sur des processus moléculaires et cellulaires qui pourraient réduire l'agressivité des NB à haut risque, et pourraient donc présenter un intérêt pour une nouvelle thérapie.

1/ Évaluation de l'activité anti-proliférative de la canthin-6-one La canthin-6-one est un alcaloïde d'origine végétale dont les propriétés antipyrétique et antiparasitaire sont utilisées en médecine traditionnelle. Une meilleure connaissance de ses propriétés anti-prolifératives et de son mode d'action sont nécessaires. Nous avons observé une inhibition complète de la prolifération de lignées cancéreuses en présence de canthin-6-one ayant pour origine une accumulation des cellules dans la phase G2/M du cycle cellulaire. La conservation phylogénétique des mécanismes du cycle cellulaire nous a permis d'utiliser la levure Saccharomyces cerevisiae pour rechercher des gènes cibles de la canthin-6-one. Nous avons identifié deux gènes de résistance correspondants à une pompe d'efflux et à une enzyme impliquée dans le contrôle qualité de la réplication à la transition G2-M.
2/ Rôle de la signalisation calcique dans la différenciation des photorécepteurs
Une meilleure connaissance des mécanismes de différenciation des photorécepteurs est importante pour la lutte contre les dégénérescences rétiniennes. Un délai d'une semaine, entre la détermination des précurseurs de photorécepteurs et l'activation transcriptionnelle de gènes de fonction, suggère l'attente d'un signal important pour cette étape de la différenciation. Par une approche pharmacologique in vitro, nous avons pu montrer que l'activation du gène de la rhodopsine dépend d'une voie de signalisation impliquant un canal activé en hyperpolarisation (HCN), des canaux calciques de type T ou R et de l'activité de la kinase calmoduline-dépendante. Le profil d'expression du canal HCN1 dans la rétine embryonnaire suggère qu'il pourrait jouer un rôle limitant dans ce mécanisme.

Les acides gras saturés (AGS) altèrent la fonctionnalité des organites dans de nombreux types cellulaires. Il a été proposé que ce processus, également nommé lipointoxication, puisse être responsable de plusieurs pathologies humaines telles que le diabète de Type 2. Au niveau cellulaire, l'accumulation d'AGS est associée à une augmentation du taux de saturation des phospholipides (PL) membranaires, les composants majoritaires des membranes des organites, mais également du taux de céramides, impliqués dans l'induction de l'apoptose. Dans une première partie de ce travail, nous avons étudié, chez le modèle cellulaire simple Saccharomyces cerevisiae, la contribution relative des PL saturés et des céramides à la cytotoxicité des AGS. Nous avons pu démontrer que les céramides agissaient à des étapes précoces de la voie de sécrétion, alors que les PL saturés impactaient des étapes plus tardives en altérant en particulier la formation de vésicules de sécrétion. Parallèlement, nous avons également constaté que le taux d'AGS était significativement augmenté dans les PL membranaires des patients atteints d'une maladie génétique, la mucoviscidose. La mutation la plus fréquente responsable de cette maladie, résulte en la rétention de la protéine correspondante dans le réticulum endoplasmique. Des molécules pharmacologiques, capables de corriger le trafic de la protéine à sa destination finale ont été isolées in vitro, mais des limitations importantes ont pu être observées lors des tests cliniques. Nous proposons dans le présent manuscrit que la lipointoxication liée aux AGS pourrait être un écueil important à l'utilisation des correcteurs actuels pour le traitement de la mucoviscidose.

L'angiogenèse est un processus physiologique qui correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau vasculaire préexistant et est régulée par l'équilibre entre les facteurs endogènes pro- et anti-angiogéniques. La rupture de cet équilibre est associée à de nombreuses pathologies dont l'ischémie, la rétinopathie ou encore la progression tumorale. Etant donné que les cellules endothéliales, principal type cellulaire composant les vaisseaux sanguins expriment les récepteurs à activité tyrosine kinase du facteur anticoagulant, la protéine S, Tyro3, Axl et Mer et produisent de la protéine S, l'objectif de ce travail est d'étudier le rôle, de la protéine S dans l'angiogenèse. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré in vivo que la protéine S inhibe l'angiogenèse induite par les facteurs pro-angiogéniques (VEGFA et FGF2). Parallèlement, nous avons observé in vitro une inhibition par la protéine S de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales induites par le VEGFA. Cet effet est corrélé à l'inhibition par la protéine S des voies de signalisation des MAP-Kinases et de la phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3) induites par le VEGFA. Nous avons ensuite mis en évidence, par l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et de petits ARNs interférents, que la protéine S inhibe, via l'activation du récepteur Mer et le recrutement de la protéine phosphatase SHP2, l'activation du VEGFR2, le principal récepteur du VEGFA. Dans la deuxième partie, nous avons montré de manière intéressante que le rôle joué par la protéine S lors de l'angiogenèse est plus complexe, puisqu'elle est capable d'activer directement la voie de signalisatio

La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative qui peut être liée à la présence de mutations génétiques au niveau du gène SNCA codant pour le pro oxydant α-synucléine. De nombreux travaux montrent que la levure Saccharomyces cerevisiae constitue un modèle utile et valable pour étudier les mécanismes moléculaires de la toxicité cellulaire de l'α-synucléine. En effet, l'expression hétérologue de l'α-synucléine chez une souche sauvage de S. cerevisiae entraîne des dysfonctionnements cellulaires identiques à ceux déjà observés dans les neurones. En plus de ces anomalies fonctionnelles, l'α-synucléine entraine une accumulation de particules lipidiques cytoplasmiques dans les levures. Afin d'élucider le rôle de ces particules lipidiques dans la toxicité cellulaire de l'α-synucléine, nous avons exprimé cette protéine dans une souche de S. cerevisiae incapable de fabriquer les particules lipidiques. De manière surprenante, l'incapacité de fabriquer les particules lipidiques rend les cellules plus tolérantes à l'α-synucléine. Nos résultats indiquent que le niveau de toxicité de l'α-synucléine est corrélé non seulement à l'activité de synthèse des acides gras mais également au statut redox cellulaire.

Le fonctionnement du système nerveux dépend de la mise en place d'un réseau complexe de connexions neuronales au cours du développement embryonnaire et postnatal. Comprendre comment ces réseaux neuronaux s'établissent est un axe majeur de la neurobiologie du développement. Au-delà de son importance fondamentale, la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires du guidage axonal représente un enjeu capital pour appréhender les situations pathologiques consécutives à des troubles lésionnels ou dégénératifs du système nerveux, compte tenu de l'importance des mécanismes développementaux dans la réparation des circuits neuronaux adultes. Au sein de l'équipe Physiopathologie des Troubles Neurodégénératifs et Adaptatifs de l'unité CNRS UMR 6187, le Pr. Afsaneh Gaillard a récemment réussi à reconstruire la voie nigrostriée dans un modèle murin de la maladie de Parkinson, par greffe de cellules embryonnaires issues du mésencéphale ventral. Afin d'identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu, nous nous sommes attachés à étudier les mécanismes de guidage axonal des neurones dopaminergiques issus du mésencéphale ventral vers leur région cible, le striatum, pendant l'embryogenèse chez la souris. De précédentes études ont suggéré l'implication du couple de molécules de guidage éphrine-A5/EphA5 en se basant sur l'expression de leurs ARNm respectivement mis en évidence dans le striatum et dans le mésencéphale ventral. Cependant, aucune implication fonctionnelle n'a été démontrée. Ainsi, nous sommes-nous tout d'abord attachés à décrire, in vivo, l'expression de la protéine éphrine-A5 par immunohistochimie dans le système nerveux central de la souris au cours du développement, avant d'émettre l'hypothèse de l'implication de l'interaction éphrine-A5/EphA5 dans la mise en place de la voie mésostriatale. Nous avons notamment détecté à proximité des axones dopaminergiques, pendant l'embryogenèse et le développement post-natal, l'expression de la protéine éphrine-A5 dans le thalamus, dans le télencéphale ventral selon un gradient décroissant rostro-caudal et ventro-dorsal, et dans le striatum. Nous avons montré, in vitro par immunocytochimie et in vivo par immunohistochimie, qu'une proportion de neurones dopaminergiques exprime la protéine réceptrice EphA5. De plus, nous avons observé, par stripe assay, que la protéine purifiée éphrine-A5 exerce un effet répulsif sur la majorité des projections dopaminergiques. Chez l'embryon dont le gène codant pour éphrine-A5 a été invalidé, nous avons mis en évidence, par western blot, une diminution de l'expression de la tyrosine hydroxylase, marqueur des neurones catécholaminergiques, dans le mésencéphale ventral. L'ensemble de ces résultats suggèrent que les éphrines-A, et plus particulièrement éphrine-A5, participent au guidage axonal et à la mise en place topographique des connexions dopaminergiques mésostriatales. Ce travail nous a amenés à proposer un nouveau modèle de guidage axonal des connexions dopaminergiques mésostriatales chez la souris, dans lequel l'interaction répulsive éphrine-A5/EphA5 participerait au maintien de la trajectoire rostro-ventrale de la voie mésostriatale et à la distribution topographique des projections dans le striatum.

Le système VIP-récepteurs désigne des neuropeptides tels que le vasoactive intestinal peptide (VIP) et le pituitary-adenylate cyclase activating protein (PACAP), et leurs récepteurs tels que les VPAC1, VPAC2 et PAC1. Ce système régule de nombreuses fonctions dans l'organisme ainsi que la prolifération et la migration de diverses cellules tumorales. Le rôle du système VIP-récepteurs a été peu étudié dans les glioblastomes (GBM), des tumeurs du cerveau. Le travail de cette thèse met en évidence ce rôle dans les cellules M059K et M059J issues d'un même GBM humain. Les résultats obtenus indiquent que les cellules M059K expriment plus le système VIP-récepteurs que les cellules M059J et notamment le récepteur VPAC1. Aucun contrôle de la prolifération cellulaire par ce système n'a été observé, en revanche la différence d'expression de ce système est associée à une moindre migration et invasion des cellules M059K par rapport aux cellules M059J, in vitro. Des expériences de modulation de l'activité du système VIP-récepteurs par des agonistes ou des antagonistes, par la surexpression du récepteur VPAC1 dans les cellules M059J ou l'addition d'un anticorps anti-PACAP dans des cultures de cellules M059K, indiquent que ce système régule négativement la migration et l'invasion de ces cellules de GBM in vitro. Une réorganisation du cytosquelette d'actine, l'activité des protéines Rac1 et Cdc42, la voie de la protéine kinase A et probablement des sites de très haute affinité pour le VIP et le PACAP participent à cette régulation. Ces résultats suggèrent que le système VIP-récepteurs pourrait contrôler la capacité des cellules de GBM à envahir le tissu environnant in vivo.

Les protéines vitamine K-dépendantes (PVKDs) sont une famille de protéines connues pour leur implication dans la régulation de la coagulation sanguine. Leur activité dépend d'une modification post-traductionnelle, la γ-carboxylation qui est inhibée par la warfarine. Deux PVKDs, les protéines S et Gas6 ont été identifiées comme ligands des récepteurs tyrosine kinase de la famille TAM. L'étude menée chez les souris invalidées pour ces récepteurs suggère une implication des PVKDs dans la neurogenèse. Chez les rongeurs, la neurogenèse assurée par les cellules souches neurales (CSN) persiste à l'âge adulte dans quelques régions cérébrales dont la zone sous-ventriculaire (SVZ). Mon travail de thèse a eu pour objectif majeur de comprendre l'effet des PVKDs sur l'activité des CSN de la SVZ mais aussi l'implication de la protéine Gas6 dans la rétinogenèse. Nos résultats montrent que l'inhibition de la sécrétion des PVKDs par la warfarine stimule la prolifération des CSN. En outre, nous montrons que les récepteurs TAM et leurs ligands sont exprimés par les CSN et dans le LCR, que la protéine S exogène inverse les effets de la warfarine et que l'absence de la protéine Gas6 chez les souris Gas6-/- induit une réduction de la prolifération des CSN. L'ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence l'implication des PVKDs dans la régulation de la prolifération des CSN. La deuxième partie de ce travail montre que les CSN possèdent une activité phagocytaire basale qui est stimulée par la protéine S. La troisième partie de ce travail montre que chez les souris Gas6-/- soumises à une lésion rétinienne, la prolifération cellulaire permettant la réparation de la lésion...

Les protéines intégrées de la membrane plasmique des cellules doivent emprunter la voie de sécrétion pour atteindre leur destination finale. Des points de contrôles, localisés tout au long de cette voie, sont capables de repérer les protéines mal repliées et de prendre en charge leur dégradation. De nombreuses études suggèrent que ces points de contrôles sont impliqués dans l'étiologie de plusieurs pathologies génétiques humaines. De plus, des données bibliographiques récentes suggèrent que la régulation de l'homéostasie lipidique cellulaire pourrait également influencer l'efficacité de ces différents points de contrôle. Au cours de ce doctorat, nous avons développé une approche nous permettant d'évaluer l'impact de perturbations de l'homéostasie lipidique sur la biogénèse d'une protéine membranaire modèle chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ainsi que sur l'intégrité physique d'un compartiment clef de la voie de sécrétion : le Reticulum Endoplasmique (RE). La levure est un microorganisme anaérobie facultatif, dans le sens où elle peut se développer en absence d'oxygène. Néanmoins, elle est alors incapable de synthétiser ses acides gras saturés ainsi que son stérol majoritaire, l'ergostérol. En nous appuyant sur cette propriété physiologique, unique dans le monde vivant, nous avons induit chez la levure des carences lipidiques contrôlées (acides gras et/ou ergostérol), et nous en avons évalué les conséquences sur la biogenèse de Fur4p, une perméase à uracile de la membrane plasmique. Nous avons démontré que les carences lipidiques résultaient en une prise en charge de la protéine par un contrôle qualité au niveau de l'appareil de Golgi, résultant en son adressage direct depuis cette organelle, via la voie endosomale, vers la vacuole pour dégradation. Un ensemble de données suggèrent que le paramètre biophysique qui contrôle la sortie de Fur4p de l'appareil de Golgi serait le stress de courbure. Parallèlement à ceci, nous avons également évalué l'effet de ces différentes carences lipidiques sur la fonctionnalité du RE et plus particulièrement sur le déclenchement de l'Unfolded Protein Response (UPR), un mécanisme permettant la prise en charge des protéines mal repliées dans ce compartiment. Nous avons constaté que l'accumulation d'acides gras saturés au sein des phospholipides provoque le déclenchement de cette réponse UPR, un phénomène amplifié par la présence d'ergostérol. Il apparaît donc que le contenu lipidique cellulaire peut directement affecter le repliement des protéines dans le RE et, en conséquence, réguler la réponse UPR. L'ensemble de ces résultats expérimentaux, obtenus chez un organisme modèle, est discuté dans le contexte de pathologies humaines, notamment associées à des dérégulations de l'homéostasie lipidique et à forte incidence, comme l'athérosclérose et l'obésité.

Ce travail porte sur deux projets ayant pour fil conducteur la transmission dopaminergique. Ces projets portent sur deux maladies psychiatriques associées, d'une manière ou d'une autre, à une hyperdopaminergie : la dépendance aux drogues et la schizophrénie. La dépendance aux drogues constitue le projet principal de ma thèse et la schizophrénie est un projet en collaboration avec l'université Américaine de Beyrouth. Dans un premier temps, nous avons étudié chez la souris l'influence d'un environnement qui mime les conditions positives comme l'environnement enrichi durant les premiers stades de vie, sur la vulnérabilité aux drogues comme la cocaïne et l'héroïne ayant des mécanismes d'actions différentes. Nous nous sommes focalisés sur le système dopaminergique mésolimbique qui projette vers le striatum ventral et qui est considéré comme un maillon central de circuit de récompense. Nos résultats montrent que les conditions environnementales positives peuvent protéger contre les effets renforçants de la cocaïne et de l'héroïne. La protection contre les effets de la cocaïne semble être médiée par une réduction de la réactivité des neurones du striatum au niveau post synaptique. Nous avons trouvé aussi une dissociation entre les effets activants et récompensants de l'héroïne reflétant que les effets récompensants de l'héroïne sont, en partie, indépendants du système dopaminergique mésolimbique. Ces études montrent que l'environnement enrichi diminue la vulnérabilité à développer l'addiction aux drogues. Ensuite, nous avons étudié l'influence de l'environnement enrichi sur les effets stimulants et récompensants de la cocaïne après l'installation de la dépendance ainsi que sur la rechute à la cocaïne. Nous avons participé à une étude montrant que les influences de l'environnement enrichi ne sont pas restreintes à son rôle protecteur contre les effets des drogues. L'environnement enrichi est aussi capable d'éliminer les conséquences comportementales et neurochimiques des injections répétées des drogues et empêcher le phénomène de rechute. De ce fait, l'environnement enrichi possède aussi un rôle curatif de l'addiction aux drogues. Concernant le deuxième axe de l'étude, nous avons étudié par hybridation in situ l'expression des gènes des récepteurs dopaminergiques D1 et D2, de la sous unités NR1 et NR2A des récepteurs NMDA glutamatergiques et des neuropeptides (substance P, enképhaline, dynorphine) dans un modèle animal de la schizophrénie. Ce modèle s'agit des rats ayant une lésion néonatale de l'hippocampe ventrale et montrant après la puberté des changements comportementaux associés à une augmentation de l'activité dopaminergique dans le striatum et un dysfonctionnement du cortex préfrontal, consistants avec la schizophrénie. Nous avons montré que l'émergence de ces comportements après la puberté est associée à une diminution de l'expression du récepteur D2 et des neuropeptides (enképhaline et substance P) dans le striatum, et une augmentation de l'expression de NR1 dans le cortex. Ces changements semblent être des mécanismes compensatoires à l'augmentation de l'activité dopaminergique dans le striatum et à l'hypofonctionnement des récepteurs NMDA dans le cortex, qui n'apparaissent, similairement à la schizophrénie, qu'après la puberté.