UPThèses

Nous avons récemment identifié chez l’Homme une nouvelle sous population lymphocytaire T constituée par les lymphocytes T (LT) CD8 innés. Ils possèdent un TCRαβ, expriment le facteur de transcription Eomesodermine, les récepteurs membranaires KIR/NKG2A et sont dotés de fonctions de type « Natural Killer » (NK-like). Leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles sont compatibles avec leur définition comme potentiel équivalent humain des LT CD8 « innate memory » décrits chez la souris, dont la génération dépend de la sécrétion de l’IL-4 par les LT exprimant le facteur de transcription « promyelocytic leukemia zinc finger protein » (PLZF), notamment les lymphocytes « invariant Natural Killer T » (iNKT). Nous avons pris appui sur le modèle physiopathologique de la leucémie myéloïde chronique (LMC) pour tester l’implication potentielle des LT CD8 innés dans l’immunosurveillance antitumorale chez l’Homme. Ce choix repose sur le fait qu’en matière de cancers, la LMC constitue un modèle d’étude du rôle du système immunitaire, comme l’attestent les données de la littérature documentant que les lymphocytes sont capables de contrôler la maladie. La LMC est une hémopathie maligne de la famille des syndromes myéloprolifératifs qui résulte de la formation d’un gène chimérique BCR-ABL1, lequel est responsable de l’expression d’une protéine dont l’activité tyrosine kinase est dérégulée. Le traitement de la LMC repose sur une thérapie ciblée non curative : les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) dont le chef de file est l’imatinib. Nous avons précédemment montré que les lymphocytes iNKT, une sous population T innée dont l’implication dans l’immunosurveillance antitumorale est clairement établie chez l’Homme et la Souris, sont anergiques chez les patients en LMC au diagnostic de la maladie. Leur défaillance fonctionnelle, notamment en termes de sécrétion d’IL-4, est corrigée chez les patients obtenant une rémission cytogénétique complète sous traitement par imatinib. Tout comme pour les lymphocytes iNKT, nos résultats montrent au diagnostic de la maladie un déficit numérique profond des LT CD8 innés, auquel s’ajoute une altération sévère de leurs fonctions NK-like (capacité de sécrétion d’IFN-γ en réponse à une combinaison de cytokines pro-inflammatoires IL-12+IL-18 et de cytotoxicité via CD16). De manière intéressante, nous avons observé chez les patients traités par imatinib et en rémission moléculaire majeure (RMM), une restauration numérique et fonctionnelle partielle en termes de sécrétion d’IFN-γ de type inné des LT CD8 innés. Les données collectées chez les témoins sains, les patients au diagnostic de la maladie et en RMM sous ITK, en mettant en évidence une association entre la fréquence des lymphocytes iNKT et celle des LT CD8 innés, renforcent l’hypothèse de l’existence chez l’Homme, à l’instar de chez la Souris, d’un axe iNKT/ LT CD8 innés. Pour éprouver notre hypothèse que les LT CD8 innés participent au contrôle de la LMC, nous avons analysé leur statut chez des patients en rémission prolongée après arrêt de leur ITK en dépit de la persistance d’une maladie résiduelle tumorale. Chez ces patients, un taux significativement plus élevé de LT CD8 innés est mis en évidence comparativement aux patients en RMM sous ITK et aux témoins sains. Leurs capacités fonctionnelles sont, de plus, restaurées de manière complète en référence aux sujets sains. L’ensemble de ces résultats qui plaide en faveur d’une implication des LT CD8 innés dans l’immunité anti-leucémique au cours de la LMC, nous conduits à émettre l’hypothèse qu’ils pourraient constituer un biomarqueur potentiel du succès d’arrêt du traitement par ITK dans la LMC et nous encouragent à explorer des stratégies d’immunothérapie antitumorale visant à valoriser leurs propriétés fonctionnelles.

Les infections à Staphylococcus aureus représentent un enjeu majeur en santé humaine et en médecine vétérinaire. L’usage excessif d’antibiotiques pour traiter ces infections a conduit à l’émergence de souches multirésistantes et incite à développer d’autres méthodes préventives comme la vaccination. A ce jour aucun vaccin n’est approuvé en médecine humaine et seulement 2 vaccins, peu satisfaisants, sont utilisés dans le contrôle de la mastite bovine. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles formulations vaccinales plus efficaces. L’objectif de ce travail de thèse est de tester de nouvelles formulations liposomales incluant des antigènes de S. aureus et différents agents immunostimulants tels que des oligodésoxynucléotides (ODN)- CpG, l’hydroxyde d’Aluminium (Al(OH)3), des protéolipides de type gemini (AG2-C16) ou des oligosaccharides modifiés dérivés de mannane (OPM). Les capacités adjuvantes de ces molécules ont été testées dans plusieurs modèles animaux. Dans le modèle bovin, l’immunisation de veaux, de génisses et de vaches enceintes montrent l’efficacité de formulations liposomales incluant l’antigène de S. aureus associé aux ODN-CpG, induisant une réponse immune humorale forte par la production d’anticorps spécifiques de type IgG1 et IgG2, capables d’inhiber les toxines de S.aureus. Dans le modèle murin, l’injection intradermique de formulations vaccinales a révélé l’efficacité des adjuvants ODN-CpG, AG2-C16 et OPM à la fois dans l’induction d’une réponse humorale forte (production d’anticorps spécifiques) mais aussi le développement d’une réponse cellulaire impliquant notamment des lymphocytes T CD8+ sécréteurs d’IFN-γ, qui jouent un rôle important dans les mécanismes de défense contre les bactéries intracellulaires. Enfin dans le but d’étudier le potentiel des vaccins liposomaux à traverser la peau, considérée comme un site d’immunisation d’intérêt, des études in vitro ont été menées sur des épidermes reconstruits de souris montrant que l’adjuvant protéolipidique AG2-C16 associé aux liposomes favorise leur passage transcutané, permettant d’envisager une utilisation en topique de ces vaccins. D’autres expériences réalisées sur des cultures de kératinocytes et de fibroblastes murins ont également montré la capacité de l’adjuvant oligosaccharidique OPM à stimuler les fibroblastes pour la production de chimiokines et de cytokines proinflammatoires, conduisant au développement d’une réponse immunitaire au vaccin plus forte. L’ensemble des résultats présentés dans cette thèse démontre que les liposomes cationiques constituent un système polyvalent de vectorisation permettant une sélection de substances immunostimulantes appropriées en fonction des caractéristiques de la réponse immunitaire souhaitées.

Le syndrome d'ischémie-reperfusion (IR), inhérent à la transplantation rénale, est caractérisé par un infiltrat leucocytaire important et des lésions tissulaires graves dont les signaux initiateurs restent à ce jour peu décrits. Postulant que la libération d'alarmines par les cellules en nécrose est décisive dans ce processus, l'objectif principal du présent travail a été d'étudier la contribution de l'alarmine IL-33 dans la genèse des lésions tissulaires dans un modèle murin d'IR rénale. Nos résultats montrent que l'IL-33 est rapidement libérée du rein après IR comme protéine circulante, dès une heure de reperfusion. Les souris IL-33gt/gt, déficientes en IL-33, sont moins sensibles aux lésions induites par l’IR, comme l'attestent le maintien de la fonction rénale et des lésions histologiques atténuées avec un recrutement de polynucléaires neutrophiles (PNN) diminué par rapport aux souris contrôles. Ceci est associé à la perte du recrutement de cellules iNKT productrices d'IFN-γ/IL-17A. Parallèlement, les souris Jα18KO, déficientes en cellules iNKT et protégées contre les lésions d'IR, possèdent également des niveaux élevés d'IL-33 circulante. Nous proposons donc que l'IL-33 endogène contribue aux lésions d'IR en favorisant le recrutement de cellules iNKT, conduisant ainsi à un recrutement amplifié de PNN au niveau du rein lésé. Notre étude, en identifiant l'alarmine IL-33 comme un médiateur précoce de la réponse immunitaire innée induite par l'IR rénale, mettant en jeu les cellules iNKT, contribue à la compréhension des mécanismes impliqués dans la genèse des lésions associées à la greffe rénale et permet de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Les cellules iNKT et T CDS innées sont présumées contribuer à l'irnmunosurveillance (IS) des cancers et sont fonctionnellement déficientes dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Notre hypothèse était que ces défauts résultent de l'incapacité des cellules dendritiques myéloïdes (mDC) à les activer. Des analyses par cytométrie en flux et microscopie confocale ont révélé une baisse de l'expression membranaire de CD 1 d, qui présente les antigènes aux cellules iNKT, à la surface des mDC des patients LMC, par comparaison aux sujets sains. Ce défaut n'est associé ni à un défaut de maturation des mDC, comme le montre l'expression normale de HLA-DR et de CDS6, ni à une baisse d'expression intracellulaire de CDld ou de son transcrit. Ces résultats sont conciliables avec une rétention intracellulaire. Le traitement in vitro des mDC des patients LMC avec un inhibiteur de la protéine ROCK restaure partiellement l'expression de surface de CD 1 d et la présentation antigénique par CD Id, alors qu'il n'a eu aucun effet sur les mDC des sujets sains. Nous proposons que la protéine ROCK, qui est activée par le domaine DH-PH de BCR-ABL, interfere avec la réponse immunitaire dépendant des lymphocytes iNKT au cours de la LMC par régulation négative de l'expression membranaire de CDld des mDC. Le fait que les cellules iNKT et T CDS innées retrouvent des fonctions normales après rémission complète de la LMC est en faveur d'une génération de cellules T CD8 innées dépendante des cellules iNKT, comme décrit chez la souris. Notre travail suggère une implication des cellules iNKT et T CD8 innées dans l'IS de la LMC et révèle l'axe ROCK/mDC comme une nouvelle cible thérapeutique dans la maladie.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne caractérisée par un syndrome myéloprolifératif. Elle est secondaire à la formation d’un gène chimérique BCR-ABL dont le produit de ce gène de fusion est une protéine possédant une activité tyrosine kinase dérégulée, nécessaire et suffisante à la leucémogénèse. Plusieurs arguments suggèrent l’implication des cellules du système immunitaire dans le contrôle de la LMC. Nous avons montré que les lymphocytes Natural Killer T invariant (iNKT), une population minoritaire de lymphocytes T non conventionnels impliqués dans l’immunosurveillance, sont anergiques chez les patients en phase chronique (LMC-PC). Ce défaut est corrigé chez les patients en rémission cytogénétique complète après traitement par Imatinib Mesylate (LMC-IM) ou IFN-α. Les lymphocytes iNKT sont impliqués chez la Souris dans la génération de cellules T CD8+ « innate-memory », une autre population de lymphocytes T innés découverte récemment chez la Souris. Nous avons mis en évidence chez l’Homme, l’existence d’une population de cellules T ayant un phénotype inné et mémoire, exprimant fortement le facteur de transcription Eomesodermine et capable de produire rapidement de l’IFN-γ en réponse à une stimulation innée par les interleukines (IL)-12 et IL-18. Cette population de cellules est déficiente sur le plan numérique et fonctionnel chez les patients LMC-PC. Ces défauts sont partiellement corrigés chez les patients LMC-IM. L’ensemble de ces résultats souligne le rôle des lymphocytes T innés dans l’immunité anti-leucémique et pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapies ciblées contre la LMC.

Les lésions d'ischémie reperfusion (IR) sont indissociables de la transplantation et leur sévérité impacte sur le devenir du greffon. Les mécanismes physiopathologiques de ces lésions restent méconnus. Les molécules HMGB1 et IL-33 sont des alarmines, capables d'initier la réponse inflammatoire et pourraient être de potentiels biomarqueurs de l'IR. Le porc est un modèle pertinent d'IR. Les cellules iNKT étant une composante de l'immunité innée impliquée dans l'IR, nous avons d'abord identifié et caractérisé ces cellules dans le sang périphérique du porc puis montré qu'elles étaient ciblées par l'IL-33. Nous avons ensuite cherché à déterminer le rôle des alarmines après IR en transplantation rénale chez l'homme. Les excrétions urinaires d'HMGB1 et d'IL-33 sont augmentées précocement après la reperfusion et les taux urinaires et sériques d'IL-33 sont corrélés avec la durée d'ischémie froide. In vitro, les cellules veineuses ombilicales humaines soumises à une séquence d'hypoxie libèrent de l'HMGB1 et de l'IL-33, alors que seule cette dernière est produite durant la phase de réoxygénation. De plus, nous avons montré que les leucocytes périphériques des receveurs étaient ciblés par HMGB1 et IL-33, comme en témoigne l'augmentation des transcrits de leurs récepteurs. Nous avons enfin mis en évidence que les cellules iNKT, ciblées par l'IL-33 mais pas par HMGB1, étaient activées une heure après transplantation. Ces résultats confortent l'hypothèse d'un rôle de l'IL-33 en tant que médiateur de la réponse immunitaire innée au cours de l'IR rénale chez l'homme.