UPThèses

Introduction : En réanimation, le sommeil est déstructuré, fragmenté et non réparateur. Ce mauvais sommeil est associé à une augmentation de la morbi-mortalité et de la durée du sevrage de la ventilation mécanique. Le sevrage ventilatoire est une période critique qui se complique dans 15% des cas. Les échecs de sevrage ventilatoire ont une physiopathologie complexe et le mauvais sommeil pourrait être impliqué en diminuant l’autonomie respiratoire des patients. Objectifs : (1) Evaluer l’impact de la privation de sommeil sur l’endurance musculaire inspiratoire et manuelle ; (2) Explorer les mécanismes physiologiques en cause chez le sujet sain ; (3) Evaluer chez le patient de réanimation la pertinence des mécanismes mis en évidence chez le sujet sain et proposer des mesures protectrices du sommeil en réanimation. Matériel et Méthodes : Chez le sujet sain, ce travail de thèse a comparé l’endurance inspiratoire et manuelle après sommeil normal et après privation aiguë de sommeil, en explorant la commande cérébrale musculaire, le muscle squelettique et les afférences musculaires. Chez le patient de réanimation, la commande cérébrale inspiratoire a été comparée entre les patients réussissant et les patients échouant leur sevrage ventilatoire. Enfin, la capacité d’un algorithme à distinguer les états de veille et de sommeil des patients de réanimation a été évaluée. Résultats : Une privation aiguë de sommeil diminuait l’endurance inspiratoire de 50% et manuelle de 11% chez des hommes sains. Cette perte d’endurance musculaire était associée à une altération de la commande musculaire corticale prémotrice et à une augmentation de la dyspnée et des afférences motrices pour un effort équivalent. Chez les patients de réanimation, une augmentation de 0,425 µV d’amplitude des potentiels prémoteurs inspiratoires prédisait l’échec de sevrage ventilatoire avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 87%. L’analyse automatique de polysomnographies de réanimation par un algorithme de détection automatique du sommeil était bien corrélée à la lecture humaine. Conclusions : Lors d’un exercice, la privation aiguë de sommeil entraine une augmentation des afférences musculaires, inhibant la commande prémotrice corticale et réduisant l’endurance des muscles striés squelettiques. La mesure des potentiels prémoteurs inspiratoires prédit efficacement l’échec de sevrage ventilatoire d’un patient intubé. Ainsi, le mauvais sommeil nuit au sevrage ventilatoire des patients. Mais la détection en direct du sommeil de ces patients ouvre la voie à une protection du sommeil tout au long du nycthémère.

Introduction : Le manque de sommeil, un trouble fréquent dans nos modes de vie actuels, est de plus en plus étudié et ses effets sur l’organisme humain sont de mieux en mieux connus. Cependant, même si l’impact négatif de la privation de sommeil sur les capacités d’endurance face à l’exercice physique commencent à être établies, très peu d’études ont porté spécifiquement sur l’endurance des muscles inspiratoires. Celles l’ayant fait ont systématiquement mis en évidence une diminution de l’endurance inspiratoire après une privation expérimentale de sommeil. Le mécanisme de ce phénomène n’a pas été élucidé, même si récemment il a été observé des indices forts d’altération de la commande centrale, pouvant être à l’origine du déficit d’endurance inspiratoire lié à la privation de sommeil. Ces éléments ont des implications cliniques potentielles, notamment en réanimation où le sevrage de la ventilation assistée nécessite une endurance suffisante des muscles inspiratoires, alors que les patients concernés souffrent de privation de sommeil sévère. Objectifs : Explorer les mécanismes de l’impact de la privation de sommeil sur l’endurance inspiratoire, par deux approches : étudier les corrélats neurophysiologiques de la fatigue inspiratoire chez l’être humain et créer un modèle animal pour explorer la commande cérébrale lors l’une tâche d’endurance inspiratoire. Méthodes : Chez l’être humain, la variabilité de la fréquence cardiaque (HRV) a été mesurée comme reflet de l’activité du système nerveux autonome durant une tâche d’endurance inspiratoire, les hautes fréquences (HF) étant considérées comme reflétant l’activité parasympathique cardiaque et les basses fréquences (LF) l’activité sympathique. Chez le rat de laboratoire, il a été mis en place un modèle d’endurance inspiratoire par contrainte mécanique externe, appliquée sur rat vigile contraint dans un pléthysmographe, précédée d’une privation de sommeil automatisée, pour évaluer l’existence d’un effet d’une privation de sommeil sur l’endurance inspiratoire. Résultats : L’analyse de l’HRV chez l’être humain a permis de retrouver une absence d’augmentation de la puissance des HF lors de la tâche d’endurance inspiratoire chez les sujets en privation de sommeil par rapport à la condition de sommeil normal, la puissance des LF n’étant pas affectée. Le modèle mis en place chez le rat de laboratoire a permis d’obtenir une privation de sommeil satisfaisante, avec une diminution de moitié de l’efficience de sommeil. Lors de l’épreuve d’endurance inspiratoire, les rats en privation de sommeil ont atteint plus rapidement le critère d’arrêt déterminant une fatigue inspiratoire que les rats en condition de sommeil normal. Conclusion : Chez l’être humain, nos résultats indiquent que la privation de sommeil induit une absence d’adaptation du système nerveux parasympathique cardiaque à l’effort imposé par une contrainte inspiratoire, ce qui pourrait participer à la diminution d’endurance inspiratoire observée. Nous avons reproduit chez le rat de laboratoire l’effet de la privation de sommeil sur l’endurance inspiratoire obtenu chez l’être humain, ouvrant la voie à une exploration plus précise des mécanismes mis en jeu, en particulier celui d’un défaut de la commande ventilatoire cérébrale.

L'ischémie reperfusion se caractérise par deux phases distinctes : une cessation puis un retour de l’apport sanguin et peut se produire dans certaines situations pathologiques et lors de la transplantation d’organes. Cette séquence d’évènements peut induire la mort cellulaire, la formation de débris cellulaires et de microparticules. Les corps apoptotiques et les microparticules se caractérisent par l’exposition de la phosphatidylsérine sur le feuillet externe de leur membrane. Les cellules lésées suite à l’ischémie reperfusion entraînent, par le relargage de cytokines/chimiokines, l’activation de l’inflammation et le recrutement de leucocytes, tel que les macrophages. Les macrophages permettent l’élimination par phagocytose des débris cellulaires et des microparticules. Il a été établi précédemment que le récepteur tyrosine kinase MerTK, exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages, joue un rôle majeur dans la phagocytose. En effet, l’interaction du récepteur MerTK avec son ligand, la protéine S, permet la formation d’un pont entre le macrophage et les phosphatidylsérines exposées par les corps apoptotiques et les microparticules. MerTK contribue aussi à une régulation négative de l’expression de certaines molécules pro-inflammatoires impliquées dans le recrutement leucocytaire. L’objectif de notre étude est de caractériser le rôle de MerTK dans le développement des lésions induites par une ischémie reperfusion rénale mais aussi dans la réparation post-ischémique. Nous avons utilisé un modèle de rats RCS (Royal College of Surgeons) caractérisés par un MerTK défectueux en raison d’une mutation naturelle dans le gène MerTK. La simulation de l’ischémie reperfusion rénale s’effectue par le clampage de l’artère et de la veine rénale. Le sang et les reins prélevés permettent d’évaluer, via des techniques d’ELISA, de Western Blot et de dosages biochimiques, des marqueurs de la fonction et de lésions rénales, d’inflammation et de recrutement leucocytaire. Les lésions histologiques sur des coupes rénales sont mises en évidence par les colorations HES-PAS, et la localisation ainsi que la quantification du recrutement leucocytaire ont été évaluées par la technique d’immunohistochimie. Nous avons par ailleurs utilisé la technique de cytométrie en flux pour quantifier les microparticules d’origine plaquettaires, endothéliales et leucocytaires dans le plasma. Enfin, nous avons étudié le rôle possible de MerTK dans la phagocytose in vitro, par co-incubation de corps apoptotiques avec des monocytes/macrophages, provenant de sang de rats RCS déficients en MerTK ou de rats contrôles exprimant normalement ce récepteur.

Il est prouvé que la conservation des greffons rénaux marginaux en machine de perfusion (MP) est bénéfique. Cependant, cette méthode nécessite des améliorations afin de minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion (I/R), par l’ajout d’oxygène et/ou d’un transporteur d’oxygène. Nous avons cherché à évaluer les effets de l’oxygénation et de l’ajout d’une hémoglobine de ver marin (HbAm, M101) durant la perfusion rénale hypothermique avant transplantation. Nos critères de jugement étaient basés sur la reprise de fonction du greffon et sur les lésions tardives de dysfonction rénale. Nous avons utilisé un modèle porcin : les reins ont été exposés à 1h d’ischémie chaude, puis perfusés dans une MP WAVES® pendant 23h à 4°C avant autotransplantation. Quatre groupes ont étudié : W (MP-21% O2), W-O2 (MP-100% O2), W-M101 (MP-21% O2 + 2g/L HbAm), W-O2+M101 (100% O2 + 2g/L HbAm), (n=6 per groupe). Les reins du groupe W-M101 ont montré un débit de perfusion plus élevé et une résistance rénale plus faible comparé aux autres groupes. Pendant la première semaine post-transplantation, les groupes W-O2 et W-M101 ont montré une créatininémie significativement plus faible et un meilleur taux de filtration glomérulaire (GFR). Les niveaux circulants de KIM-1 et IL-18 étaient plus faibles dans le groupe W-M101, tandis que les niveaux de NGAL et d’ASAT étaient plus faibles dans les groupes d’oxygénation active. Trois mois post-transplantation, la fraction excrétée de sodium et le ratio protéinurie/créatininurie étaient plus élevé dans le groupe W. La créatininémie était plus faible dans le groupe W-M101. La fibrose interstitielle a évalué à 3 mois post-transplantation étaient plus faible dans les groupes W-M101 et W-O2+M101. Nous avons révélé histologiquement que l’infiltration de mastocytes était significativement élevée dans le groupe W comparé aux autres groupes. Nous avons montré que la combinaison de 21% O2 + hémoglobine améliorent la reprise de fonction du greffon rénale.

Le carcinome épidermoïde cutané (CEC) est l'un des cancers les plus fréquents et il est résistant aux traitements chimiothérapeutiques classiques. De nombreuses études montrent que selon leur phénotype les cellules du microenvironnement inflammatoire peuvent inhiber (cellules Th1/M1) ou favoriser (cellules Th2/M2) le développement tumoral. En fonction des cytokines présentes dans ce microenvironnement, il est possible de reprogrammer les cellules immunitaires et de les rendre moins permissives au développement tumoral. L’onconstatine M (OSM) est une cytokine aux effets pléiotropes, elle peut favoriser la prolifération, l’invasion tumorale des cellules tumorales et induire une polarisation immunitaire Th2/M2. Nous avons montré que l'OSM a des effets pro-inflammatoires au niveau cutané et qu’elle module le phénotype des kératinocytes normaux mais son rôle dans les CEC n’est pas décrit. Nous avons donc étudié l’implication de l'OSM dans le développement des CEC. Nous avons montré que l'OSM était surexprimée dans les CEC humains ainsi que d'autres cytokines comme l'IL-6, l'IL-1β, l'IFNγ suggérant une polarisation Th1/M1 des cellules du microenvironnement. In vitro, l'OSM induit l’activation de voies de signalisation pro-tumorales (STAT3 - ERK) au niveau de kératinocytes murins malins ainsi que leur prolifération et leur migration. La greffe de ces cellules chez la souris entraine le développement de CEC associés à une surexpression d'OSM. Enfin, l’absence d'OSM entraine une diminution du volume tumoral de 30% et à une réduction de la polarisation M2. Collectivement, ces résultats suggèrent un rôle pro-tumoral de l'OSM dans le développement des CEC et le blocage de cette cytokine pourrait constituer une nouvelle alternative thérapeutique.

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs.

En préservation-transplantation rénale, l’ischémie-reperfusion (IR) induit inflammation, fibrose, dysfonction et perte du greffon. Les événements d’IR sont de mieux en mieux identifiés, mais leurs complexité limite prédiction et thérapeutique. A partir d’une analyse bibliographique détaillée, nous proposons un modèle par agents de la réponse rénale aux lésions d’IR au niveau cellulaire/tissulaire, réalisé avec l'outil de modélisation NetLogo. Dans un premier temps, nous développons un modèle dynamique de l’oxygénation du cortex rénal, avec apport et diffusion de l’oxygène (O2), et consommation dépendant de la filtration. Nous adaptons ce modèle à l’état stationnaire pour l’O2, puis nous couplons les niveaux de PO2 à l'état énergétique (ATP) des cellules épithéliales et endothéliales (avec voies aérobie et anaérobie). Le statut de viabilité cellulaire est lié au niveau d'ATP, aboutissant à une représentation semi-phénoménologique de la réparation/survie vs apoptose/nécrose. Enfin, nous explorons le destin cellulaire et tissulaire lors d’IR simulées, avec l’ajout progressif d’éléments clefs de l’inflammation (invasion tissulaire par leucocytes, signaux lésionnels, phagocytose) et de la fibrose (fibroblastes, collagène). L’évolution du modèle vers la résolution de l’inflammation/régénération du tissu ou vers la fibrose tissulaire est observée selon les conditions imposées (durée/intensité, ischémie vs hypoxémie). Cette construction constitue le premier modèle des effets de l’oxygénation sur la dynamique cellulaire-tissulaire de l’inflammation-fibrose rénale en réponse à l’IR. A terme, elle permettra d'aborder clinique et thérapeutique de la conservation-transplantation rénale.

La télangiectasie hémorragique héréditaire (HHT) est une maladie rare (1/10.000). Son incidence est plus élevée (pouvant atteindre 1/1000) dans certaines zones géographiques dont la région Poitou-Charentes. Cette maladie autosomique dominante est causée par des mutations d'un des trois gènes identifiés ENG, ACVRL1 et SMAD4 codant pour des protéines de la voie BMP spécifiquement exprimés dans les cellules endothéliales. Le nombre croissant de mutations détectées chez les patients et l'expressivité variable de certaines mutations nous a ammené à déterminer les conséquences de mutations afin d'établir une corrélation génotype/phénotype. Cette corrélation est importante pour le conseil génétique et évidemment le diagnostic prénatal. Dans ce contexte, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations. L'effet délétère de ces mutations sur la protéine et/ou l'épissage de l'ARN a été évalué. Nous avons montré que sur les 23 mutations d'ACVRL1 : 1) 18 mutations faux-sens affectent la fonctionnalité de la protéine en réponse à BMP9 et 3 mutations sont de simples polymorphismes, 2) la mutation exonique c.733A>G (p.Ile245Val) affecte l'épissage de l'exon 6, 3) La mutation c.1048+5G>A de l'intron 7 en dehors du site consensus induit un épissage aberrant de l'exon 7. En ce qui concerne l'ENG, nous avons analysé 4 mutations et nous avons montré que la mutation c.1088G>A (p.Cys363Tyr) a un impact sur l'activité du récepteur et que les mutations c.1134G>A (p.Ala378Ala) et c.1060C>T (p.Leu364Leu) altèrent l'épissage de l'exon 8. Ce travail montre l'importance de l'étude approfondie de toute nouvelle mutation par des études in silico, in vitro et in cellulo à différents niveaux cellulaires. Des études in vivo ultérieures peuvent compléter et appuyer la stratégie expérimentale que nous avons suivie.

L'ischémie-reperfusion (IR) est un syndrome associant un arrêt de la perfusion sanguine suivie de son rétablissement au sein d'un organe. L'IR est rencontrée dans de nombreuses pathologies telles que le syndrome coronarien aigu, la chirurgie vasculaire mais également durant la transplantation d'organes solides au moment de la préservation de l'organe. L'ischémie entraîne de nombreux désordres métaboliques générant un stress cellulaire parmi lequel deux organelles sont particulièrement touchées : la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE). Notre projet de recherche visait à comprendre l'impact du stress du RE et de sa réponse, appelée Unfolded Protein Response (UPR), au cours de l'IR. Nous avons étudié la cinétique d'activation et le rôle de chacune des voies de l'UPR – IRE1α–XBP1, PERK-eIF2α-ATF4 et ATF6 – dans la survie des cellules endothéliales artérielles humaines soumises à différentes durées d'IR. Nous avons observé une activation successive des voies PERK-eIF2α-ATF4, ATF6 et IRE1α-XBP1 en fonction de la durée de l'ischémie froide. À l'aide de méthodes bioinformatiques, d'agents pharmacologiques et de techniques d'extinction génique post-transcriptionnelle (siRNA) nous avons observé que la voie ATF6 était délétère, que la voie PERK-eIF2α-ATF4 était protectrice lorsqu'elle était maintenue activée durant l'ischémie et que la voie IRE1α-XBP1 avait un rôle dual. Par extrapolation à la clinique, nos résultats indiquent que l'UPR est une voie d'intérêt thérapeutique pour optimiser la survie des greffons ainsi que la qualité de vie des patients et que ses médiateurs pourraient permettre d'estimer la qualité du greffon lors de la transplantation.

Un réseau de cytokine complexe a été décrit dans le psoriasis mettant en évidence le rôle central des cytokines proinflammatoires dans la physiopathologie de cette maladie. Notre tentative de modéliser l'inflammation cutanée a montré que la combinaison de l'IL-17A, IL-22, IL-1α, oncostatine M (OSM) et le TNFα, augmente de manière synergique l'expression de chimiokines et de peptides antimicrobiens, reflétant certaines caractéristiques du psoriasis. D'autres caractéristiques de cette maladie sont l'acanthose et le blocage de la différenciation des kératinocytes. Notre premier objectif était d'étudier le rôle respectif de ces cytokines sur la différenciation des kératinocytes en comparaison avec les lésions de patients psoriasiques. Toutes ces cytokines inhibent l'expression des marqueurs de différentiation des kératinocytes, parmi lesquelles l’IL-22 et l’OSM sont les plus puissantes et le mélange M5 présente des effets synergiques. Si l'IL-22 et l'OSM déclenchent plus spécifiquement l'hyperplasie épidermique et le blocage de la différenciation, l’IL-1α, IL-17A et le TNFα sont plutôt impliqués dans l'activation de l'immunité innée. Le rôle fonctionnel de chacune de ces cytokines in vivo a été étudié dans un modèle d'inflammation cutanée de type psoriasique induit par l'imiquimod (IMQ), un agoniste TLR7, en utilisant des souris déficientes en cytokines. L'absence de l'OSM ou de l'OSMRβ n'a pas modifié le développement des lésions inflammatoires induites par l’IMQ. Une hypothèse est que d'autres cytokines peuvent avoir des effets redondants avec l'OSM. L'absence de l'IL-22 chez la souris diminue partiellement les lésions cutanées induites par l'IMQ, démontrant que son retrait du réseau cytokinique rompt une partie des effets synergiques des cytokines in vivo comme présenté dans le modèle M5. L'absence de l'IL-1α ou de l'IL-1β ne modifie pas l'inflammation cutanée induite par l'IMQ, ce qui n'est pas surprenant au vu des activités redondantes de ces deux cytokines. La diminution partielle de l'inflammation en absence d'IL-1α ET d'IL-1β OU de la chaine réceptrice commune IL-1RI confirme ces observations. A long terme ces études devraient permettre de proposer des stratégies anti-cytokine ciblées et combinées pour tenter de rompre la synergie et diminuer ainsi toutes les composantes de la réponse inflammatoire cutanée.