UPThèses

La transplantation est la meilleure alternative en cas d'insuffisance rénale terminale. Face à la pénurie de greffons, les équipes de transplantation se sont tournées notamment vers les donneurs décédés par arrêt circulatoire (DDAC) non contrôlés. Ces greffons soumis à une période d'ischémie chaude sont plus fragiles. Des méthodes de reconditionnement chez le donneur par refroidissement in situ (RIS) et circulation régionale normothermique (CRN) se sont développées afin de réduire les lésions d'ischémie-reperfusion. Le choix de la méthode est laissé à l'appréciation de chaque équipe et il existe une grande hétérogénéité des pratiques. Après prélèvement, l'utilisation des machines de perfusion hypothermique (MPH) est généralement recommandée. L'optimisation de ces phases de reconditionnement chez le donneur et de conservation hypothermique apparait comme un enjeu majeur de santé publique. Concernant l'optimisation du mode de reconditionnement, la mise au point d'un modèle préclinique porcin parfaitement reproductible a permis de mettre en évidence une supériorité de la CRN sur le RIS. Une durée de CRN de 4 heures minimum sans dépasser 6 heures paraît optimale. Concernant la conservation hypothermique, les MPH permettent le maintien du niveau d'expression des gènes retrouvé en fin de CRN. L'ajout d'une oxygénation active en MPH ou de curcumine en solution statique améliore le devenir du greffon à court et long termes dans un modèle préclinique d'autogreffe. Ce travail pourrait s'étendre à l'étude d'autres organes, d'autres durées d'ischémie chaude et aux DDAC contrôlés afin d'élargir encore le nombre d'organes éligibles à la transplantation.

La pénurie de greffons rénaux a conduit à élargir les prélèvements aux donneurs décédés après mort encéphalique (DME) à critères élargis et aux donneurs décédés après arrêt circulatoire (DDAC). Ces organes sont à risque d'être non greffés ou de présenter des non reprises de fonction primaire et une durée de vie plus limitée. Ces greffons souffrent des mécanismes d'ischémie-reperfusion inhérents au processus de prélèvement-conservation-greffe. Ces donneurs sont soumis à des phénomènes physiopathologiques qui leur sont propres et dont la compréhension pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Un modèle porcin de DME a permis d'établir que la cinétique de passage en mort encéphalique impacte sur la reprise de fonction primaire (RFP) par le biais de la réponse au stress oxydant (voie de SIRT1, PGC1-α, NRF2). La balance NRF2-mTOR pourrait également influencer la genèse de lésions. Le préconditionnement par un analogue de la spermidine améliore les RFP par diminution du stress oxydant, stimulation de PGC1-α et stimulation de l'autophagie par mTOR. Un modèle porcin de DDAC a permis d'établir que le reconditionnement par circulation régionale normothermique passe par la stimulation de l'érythropoïèse et de l'angiogenèse via HIF1-α, de eNOS et de la thrombomoduline avec un temps optimal de 4h. Au-delà une activation de la coagulation par la libération de TF induit une inflammation par stimulation des protease activating receptors. L'utilisation d'une molécule anti-IIa et anti-Xa durant la conservation permet d'améliorer les suites de greffe. La compréhension des principes physiopathologiques propres aux donneurs permet de mettre place des reconditionnements innovants.

Il est prouvé que la conservation des greffons rénaux marginaux en machine de perfusion (MP) est bénéfique. Cependant, cette méthode nécessite des améliorations afin de minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion (I/R), par l’ajout d’oxygène et/ou d’un transporteur d’oxygène. Nous avons cherché à évaluer les effets de l’oxygénation et de l’ajout d’une hémoglobine de ver marin (HbAm, M101) durant la perfusion rénale hypothermique avant transplantation. Nos critères de jugement étaient basés sur la reprise de fonction du greffon et sur les lésions tardives de dysfonction rénale. Nous avons utilisé un modèle porcin : les reins ont été exposés à 1h d’ischémie chaude, puis perfusés dans une MP WAVES® pendant 23h à 4°C avant autotransplantation. Quatre groupes ont étudié : W (MP-21% O2), W-O2 (MP-100% O2), W-M101 (MP-21% O2 + 2g/L HbAm), W-O2+M101 (100% O2 + 2g/L HbAm), (n=6 per groupe). Les reins du groupe W-M101 ont montré un débit de perfusion plus élevé et une résistance rénale plus faible comparé aux autres groupes. Pendant la première semaine post-transplantation, les groupes W-O2 et W-M101 ont montré une créatininémie significativement plus faible et un meilleur taux de filtration glomérulaire (GFR). Les niveaux circulants de KIM-1 et IL-18 étaient plus faibles dans le groupe W-M101, tandis que les niveaux de NGAL et d’ASAT étaient plus faibles dans les groupes d’oxygénation active. Trois mois post-transplantation, la fraction excrétée de sodium et le ratio protéinurie/créatininurie étaient plus élevé dans le groupe W. La créatininémie était plus faible dans le groupe W-M101. La fibrose interstitielle a évalué à 3 mois post-transplantation étaient plus faible dans les groupes W-M101 et W-O2+M101. Nous avons révélé histologiquement que l’infiltration de mastocytes était significativement élevée dans le groupe W comparé aux autres groupes. Nous avons montré que la combinaison de 21% O2 + hémoglobine améliorent la reprise de fonction du greffon rénale.

Les gliomes malins sont les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central. Les glioblastomes représentant plus de 50% des gliomes, constituent la forme la plus agressive et sont particulièrement résistants à la radiochimiothérapie. Au sein de ces tumeurs réside une sous-population de cellules souches tumorales (CSG) qui pourrait être responsable de leurs initiation, progression et résistance aux traitements. Ces processus sont gouvernés par des voies de signalisation, pour la plupart activées de manière constitutive et dont l’étude est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la gliomagenèse. L’objectif de ces travaux de thèse consistait en l’exploration des voies de signalisation STAT3 et Hippo dans les gliomes dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. La première partie de ces travaux a montré que la phosphorylation S727 de STAT3 jouait un rôle important dans la radioresistance des CSG et que son inhibition pharmacologique induisait leur radiosensibilisation. Dans un second temps, ces travaux ont montré que deux effecteurs de la signalisation Hippo, YAP1 et TEAD3, sont associés à un mauvais pronostic et qu’ils seraient impliqués dans la prolifération cellulaire et le phénotype des CSG notamment par inhibition de la signature proneurale. Ainsi, ces travaux visent à proposer de nouvelles pistes thérapeutiques, d’une part l’inhibition de la pS727-STAT3 afin de potentialiser les effets de la radiothérapie et d’autre part, les effecteurs de la signalisation Hippo comme biomarqueurs pronostiques et potentielles cibles thérapeutiques.

L’infarctus du myocarde est une des premières causes de décès dans le monde. Sa prise en charge repose sur une reperfusion précoce. De façon paradoxale, la reperfusion induit des lésions délétères qui participent à la nécrose de l’organe. Parmi les stratégies de cardioprotection qui visent à limiter la formation de ces lésions, il a été décrit que l’utilisation d’anticoagulants au moment de la reperfusion avait un effet bénéfique sur la taille finale d’infarctus chez l’animal. La cardioprotection induite par ces molécules serait liée à la modulation des phénomènes thrombo-inflammatoires impliqués dans la formation des lésions de reperfusion. Nous nous sommes intéressés à deux anticoagulants inhibant le facteur X activé, le fondaparinux et le rivaroxaban, à l’aide d’un modèle d’ischémie-reperfusion (IR) myocardique chez le rat et de modèles cellulaires d’hypoxie-réoxygénation. Nos résultats montrent que ces deux molécules ont un effet cardioprotecteur à la phase aigue de la reperfusion via des mécanismes différents. La cardioprotection induite par le fondaparinux n’est pas liée à un effet anti-inflammatoire. En revanche, cet anticoagulant induit une modulation du phénotype endothélial au cours de l’IR avec l’augmentation de l’expression de deux molécules cytoprotectrices, la thrombomoduline et le récepteur endothélial de la protéine C. Concernant le rivaroxaban, son effet bénéfique serait lié à un effet cytoprotecteur au niveau des cardiomyocytes. Cette étude confirme l’intérêt des anticoagulants dans la cardioprotection et précise les cibles cellulaires impliquées, ouvrant des perspectives intéressantes concernant l’inhibition de la coagulation au cours de l’IR.

Le carcinome épidermoïde cutané (CEC) est l'un des cancers les plus fréquents et il est résistant aux traitements chimiothérapeutiques classiques. De nombreuses études montrent que selon leur phénotype les cellules du microenvironnement inflammatoire peuvent inhiber (cellules Th1/M1) ou favoriser (cellules Th2/M2) le développement tumoral. En fonction des cytokines présentes dans ce microenvironnement, il est possible de reprogrammer les cellules immunitaires et de les rendre moins permissives au développement tumoral. L’onconstatine M (OSM) est une cytokine aux effets pléiotropes, elle peut favoriser la prolifération, l’invasion tumorale des cellules tumorales et induire une polarisation immunitaire Th2/M2. Nous avons montré que l'OSM a des effets pro-inflammatoires au niveau cutané et qu’elle module le phénotype des kératinocytes normaux mais son rôle dans les CEC n’est pas décrit. Nous avons donc étudié l’implication de l'OSM dans le développement des CEC. Nous avons montré que l'OSM était surexprimée dans les CEC humains ainsi que d'autres cytokines comme l'IL-6, l'IL-1β, l'IFNγ suggérant une polarisation Th1/M1 des cellules du microenvironnement. In vitro, l'OSM induit l’activation de voies de signalisation pro-tumorales (STAT3 - ERK) au niveau de kératinocytes murins malins ainsi que leur prolifération et leur migration. La greffe de ces cellules chez la souris entraine le développement de CEC associés à une surexpression d'OSM. Enfin, l’absence d'OSM entraine une diminution du volume tumoral de 30% et à une réduction de la polarisation M2. Collectivement, ces résultats suggèrent un rôle pro-tumoral de l'OSM dans le développement des CEC et le blocage de cette cytokine pourrait constituer une nouvelle alternative thérapeutique.

L'augmentation des résistances aux antibiotiques ces dernières années et le faible nombre de nouveaux antibiotiques récemment approuvés ont suscité un intérêt considérable pour les associations médicamenteuses. Parmi celles-ci, les associations β-lactamine-inhibiteur de β-lactamases, comme l’aztréonam-avibactam (ATM-AVI), visent à surmonter la résistance due à la production de β-lactamases, l'un des principaux mécanismes de résistance chez les bactéries à Gram négatif. Cependant, les interactions PD entre molécules associées peuvent être complexes. Afin de mieux comprendre la PK/PD de l’ATM-AVI, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse : i. La PK de l’ATM-AVI au site infectieux. Une étude de microdialyse réalisée chez le rat avec ou sans péritonite a montré que la distribution de l’ATM-AVI dans le liquide péritonéal était rapide et que les concentrations au site infectieux pourraient être prédites à partir des concentrations sanguines. ii. L’interaction PD entre ATM et AVI. Des études de checkerboard analysées avec un modèle Emax ont permis de caractériser l’effet de l’AVI sur la CMI de l’ATM en termes d’efficacité et de puissance en présence de souches multi-résistantes. Pour compléter ces résultats, un modèle PK/PD a été développé à partir de données in vitro afin d’évaluer l’évolution de l’effet combiné de l’ATM-AVI au cours du temps et d’étudier la contribution individuelle de chacun des effets de l’AVI à l’activité combinée. Selon les résultats de cette modélisation, l’activité bactéricide de l’association serait principalement expliquée par l’effet potentialisateur de l’AVI et ce malgré sa capacité à prévenir la dégradation de l’ATM de manière efficace.

De nombreuses affections chez l’enfant et l’adulte sont associées à une exposition in utero à des perturbateurs endocriniens (PE). Pour réduire cette exposition, des programmes d’éducation pour la santé environnementale périnatale se développent. Ils font évoluer des dimensions psychosociales que sont la perception du risque (PR) et la croyance en l’action de réduction de l’exposition (CAR), mais peu d’entre eux sont évalués L’étude de recherche interventionnelle PREVED a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un programme d’éducation pour la santé environnementale pour des femmes enceintes, visant à diminuer leur exposition aux PE. Les objectifs de ces travaux métrologiques étaient de développer des outils (i) analytiques et (ii) épidémiologiques en vue d’évaluer l’efficacité du programme. Ainsi, (i) des méthodes analytiques ultrasensibles par LC-MS/MS permettant de doser les fractions non conjuguées de PE dans les urines et le colostrum ont été développées et validés sur des prélèvements recueillis dans le cadre de la cohorte périnatale EDDS; (ii) un questionnaire psychosocial explorant la PR, la CAR et les connaissances des femmes enceintes au moyen de scores a été conçu. Ces travaux s’inscrivent dans une approche interdisciplinaire de santé environnementale. Ils proposent des méthodes analytiques fiables pour mesurer l’exposition aux PE étudiés d’une part, et un questionnaire évaluant connaissances, attitudes et pratiques des femmes enceintes sur la question des PE d’autre part. Ces outils permettront de mesurer l’impact du programme d’éducation pour la santé environnementale périnatale.

OBJECTIF : L’intégrité vasculaire est une pierre angulaire de la viabilité des organes solides, notamment en cas de transplantation. L’objectif de ce travail est de décrire les modifications du réseau vasculaire du cortex rénal dues à une séquence d’ischémie-reperfusion (IR) induite dans un modèle préclinique porcin d’autotransplantation rénale. MATÉRIELS ET MÉTHODES : Nous avions mis en place une technique d’analyse de la microvascularisation corticale rénale après acquisition microscanner et traitement des images de reins de porc perfusés avec un polymère de silicone radio-opaque. RÉSULTATS : L’ischémie-reperfusion rénale induit une diminution corticale du volume du segment vasculaire associée à une raréfaction des microvaisseaux inférieurs à 30 µm en particulier dans la corticale interne. Dans le cortex, une augmentation de la connectivité caractérisée par une augmentation des bifurcations et une diminution du facteur d’arborescence a été observée. L’hypercholestérolémie associée à l’ischémie-reperfusion entraine une raréfaction microvasculaire dans la corticale moyenne. Trois mois post-autotransplantation, l’augmentation de la durée de conservation des greffons induit une augmentation significative de l’épaisseur de la zone corticale, un effondrement du pourcentage de microvaisseaux. CONCLUSION : Trois mois après autotransplantation rénale, l’ischémie-reperfusion induit une raréfaction des microvaisseaux de la corticale interne. Nos résultats suggéreraient que l’altération de la fonction rénale chez des greffons pourrait être liée à une hypoxie chronique et une fibrose induite par une raréfaction microvasculaire proportionnelle à la durée de la conservation.

Le métabolisme énergétique est le principal facteur déterminant de la viabilité cellulaire. Les maladies présentent de nombreuses anomalies métaboliques et énergétiques. En effet, les cellules altérées proviennent de procédés exergoniques et émettent de la chaleur vers leur environnement proche. De nombreux processus irréversibles peuvent se produire en modifiant le taux de production d'entropie. Ce niveau représente une quantité thermodynamique qui mesure ces processus irréversibles. Le niveau d'entropie est augmenté par plusieurs anomalies métaboliques et thermodynamiques dans les tumeurs cérébrales, les processus inflammatoires et les maladies neurodégénératives. Les travaux de recherche de cette thèse ont démontré et mis en évidence l'existence d'une diaphonie entre la voie canonique WNT/beta-caténine et le PPAR gamma qui joue un rôle majeur dans la reprogrammation du métabolisme de l'énergie cellulaire entre la phosphorylation oxydative, la glycolyse aérobie et la glycolyse anaérobie, dont le point d'équilibre de cette diaphonie entre ces voies moléculaires varie selon les maladies. Ces maladies sont des structures dissipatives, qui échangent de l'énergie ou de la matière avec leur environnement. Ce sont des systèmes ouverts, loin de l'équilibre thermodynamique qui opèrent sous un régime non linéaire évoluant vers des états non stationnaires. La thermodynamique loin de l'équilibre est une notion axée sur les rythmes circadiens. En effet, les rythmes circadiens participent directement à la régulation de cette diaphonie étudiée. Celle-ci représente une cible innovante dans le cadre l'imagerie moléculaire pour le diagnostic positif et différentiel de ces maladies.