UPThèses

La lutte contre le tabagisme est un enjeu majeur de santé publique et s’articule autour de politiques de lutte anti-tabac ainsi que d’une prise en charge individuelle, allant du conseil minimal aux pharmacothérapies du sevrage tabagique. Cette prise en charge a une efficacité limité sur le long terme avec un fort taux de rechute et il persiste de fortes disparités quant au succès d’un sevrage selon la présence de comorbidités et la tolérance des symptômes liés au sevrage tabagique. L’enjeu actuel de la recherche est de développer de nouvelles approches thérapeutiques et d’enrichir les connaissances des facteurs de succès ou d’échec du sevrage tabagique afin de développer des approches personnalisées. C’est dans cette démarche que s’inscrit ce travail de thèse qui visait à identifier les leviers sur le plan thérapeutique et cognitif afin d’améliorer la prise en charge des fumeurs. La première partie était une approche thérapeutique du sevrage tabagique. Nous avons réalisé une revue systématique et méta-analyse dont l’objectif était d’identifier des candidats médicaments du sevrage tabagique agissant sur le système adrénergique qui intervient dans le développement d’un affect négatif lié à l’arrêt du tabac. Ce travail a identifié les effets de la clonidine, un alpha-2 agoniste, sur l’abstinence tabagique de 989 fumeurs ainsi que des alpha-1 bloquants prazosine et doxazosine sur la réduction de consommation de 319 patients alcooliques. Nous avons construit ensuite un projet d’essai clinique dont l’objectif est d’évaluer l’efficacité de la doxazosine, dans le sevrage tabagique. Dans un second temps, nous avons souhaité réévaluer les données sur l’efficacité de la cigarette électronique à la nicotine dans l’arrêt et la réduction du tabagisme en ciblant la durée de son effet. Notre méta-analyse montre une efficacité durable, jusqu’à 12 mois de suivi, de la cigarette électronique avec nicotine comparativement à un dispositif sans nicotine et aux substituts nicotiniques dans l’arrêt du tabac. La seconde partie de ce travail était une approche cognitive sur les facteurs de succès et d’échec du sevrage tabagique. Nous nous sommes intéressés au lien entre l’abstinence tabagique et certaines caractéristiques psychopathologiques à un an de suivi post-sevrage des participants à un essai clinique de sevrage tabagique. Deux études ont été réalisées: la première portant sur l’association entre les 5 dimensions de l’impulsivité et le sevrage tabagique et la seconde sur le développement de différentes maladies mentales lors de l’arrêt du tabac. Nos résultats suggèrent que 2 dimensions de l’impulsivité, l'urgence positive et négative, peuvent jouer un rôle dans la réussite du sevrage tabagique et que le développement de symptômes dépressifs et d’une consommation alcoolique lors de l’arrêt sont des facteurs péjoratifs d’abstinence. Dans un second temps, nous présentons les résultats d’une étude dont l’objectif était d’identifier des caractéristiques démographiques, sociales, psychiatriques et addictologiques chez 161 patients bipolaires ou unipolaires, inclus dans une base de données selon leur statut tabagique. Les patients fumeurs rentrent plus précocement dans la maladie psychiatrique et sont majoritairement bipolaires avec une maladie déséquilibrée. Nos recherches ont également identifié que les traitements du sevrage tabagique peuvent induire des insomnies ou parasomnies (rêves vifs, anormaux), facteurs de mauvaise observance. Nous avons réalisé une méta-analyse en réseau sur les troubles du sommeil induits par les traitements usuels du sevrage tabagique. Notre analyse sur 25 011 patients montre un profil plus favorable des substituts nicotiniques pour l'insomnie et du bupropion pour les parasomnies. L’ensemble des résultats de notre travail ont été confrontés aux données de la littérature afin de proposer des approches thérapeutiques nouvelles et ciblées dans le sevrage tabagique.

L’antibiorésistance est un phénomène décrit depuis la découverte des premiers antibiotiques. Cependant, leur utilisation déraisonnée, à la fois en santé humain et vétérinaire, a favorisé l’émergence et l’installation de mécanismes de résistance à de nombreuses classes d’antibiotiques, dont les bêta-lactamines. Cette classe constitue le traitement de référence des infections à bacilles Gram-négatifs, comme Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. De nouvelles bêta-lactamines, comme l’association ceftolozane/tazobactam, ceftazidime/avibactam ou encore le cefiderocol, ont été développées pour être efficace sur les bactéries multi-résistantes. L’émergence de mécanismes de résistance spécifiques à ces molécules a malheureusement été décrite lors de leur utilisation clinique. De plus, de nombreux outils de diagnostics, comme le séquençage du génome entier, permettent d’identifier le ou les mécanismes potentiellement responsables de la résistance. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’utiliser des approches complémentaire de microbiologie, incluant de la biologie moléculaire, à des méthodes de modélisation de données, afin de caractériser des mutations responsables de résistance aux nouvelles bêta-lactamines. Dans une première partie, un couple de P. aeruginosa, initialement sensible au ceftolozane/tazobactam, puis devenu résistant sous traitement par cette association, a été spécifiquement étudié. Les mutations probablement responsables de la résistance ont été identifiées par séquençage génome entier (AmpC:p.G183D et AmpD:p.H157Y), puis reproduites dans une souche de référence (PAO1). Les données expérimentales ont montré une décorrélation entre les mesures de concentration minimal inhibitrice (CMI) et les résultats de courbes de bactéricidie (TKC). La modélisation semi-mécanistique pharmacocinétique/pharmacodynamique a permis de décrire de façon précise l’impact de chaque mutation, en incluant la contribution dans la résistance acquise (effet immédiat) et la résistance adaptative. Les outils utilisés lors de cette première partie ont permis l’obtention de résultats sur la sensibilité à l’imipénème et au ceftazidime/avibactam. Ces données sont importantes pour comprendre l’effet de mutations individuelles et associées sur la sensibilité aux antibiotiques, notamment dans le cadre du développement des antibiogrammes in silico. Dans une seconde partie, la résistance au cefiderocol apparue dans des souches cliniques de K. pneumoniae a été investiguée grâce à la mise en place de méthodes de séquençage de troisième génération au sein du laboratoire. La description de tous les mécanismes de résistance déjà présents a pu être réalisée, et une nouvelle mutation dans le gène fiu, jamais identifiée dans une souche clinique, a pu être mise en évidence.

L’antibiorésistance, phénomène qui caractérise la capacité des bactéries à résister aux antibiotiques, constitue l’une des plus graves menaces de santé publique selon l’Organisation Mondiale de la Santé. En effet, les infections dues aux bactéries multi-résistantes pourrait devenir la principale cause de mortalité à l’horizon 2050. Afin de maintenir l’efficacité des traitements actuels et pour lutter contre l’émergence de nouvelles résistances, les antibiotiques sont de plus en plus utilisés en combinaison. Dans ce contexte, la modélisation PKPD permet d‘étudier, de développer et d’optimiser les traitements antibiotiques. Ce travail de thèse vise à démontrer l’intérêt de cet outil dans l’étude des combinaisons d’antibiotiques, au travers de deux études : 1. Une étude de développement d’un design optimisé de checkerboard, permettant de caractériser les combinaisons d’antibiotiques. Dans cette étude, il a été montré que le design rhombique permettait caractériser efficacement les interactions PD entre antibiotiques utilisés en combinaison, tout en réduisant considérablement la charge de travail expérimental. Le design proposé était particulièrement adapté aux études de screening des combinaisons d’antibiotiques. 2. Une étude de l’interaction PD entre la ceftazidime/avibactam et la colistine contre quatre souches cliniques de Klebsiella pneumoniae multi-résistantes. Dans cette étude, des expériences de time-kill in vitro ont été réalisées avec la ceftazidime/avibactam et la colistine seul et en combinaison, et l’interaction entre ces molécules a été caractérisée au cours du temps à l’aide d’une approche de modélisation PKPD.

Les tumeurs sébacées (TSs) sont des tumeurs cutanées rares, à la fois bénignes (adénomes sébacés ou ASs et sébacéomes ou Ss) et malignes (carcinomes sébacés ou CSs). Une proportion importante survient dans le cadre d’un syndrome de Muir-Torre-Syndrome de Lynch (SMT-SL). Ce syndrome peut être dépisté par immunohistochimie (IHC) et par biologie moléculaire (BM) qui permettront la détermination d’un phénotype « mismatch repair déficient » (dMMR) et par un score clinique de risque de la Mayo-Clinic, pour déterminer quels patients doivent avoir un génotypage. La présence d’un phénotype dMMR ne signifie pas que la tumeur est d’origine germinale, de nombreuses TSs étant sporadiques. Le phénotype dMMR est fréquent (70,7%), et une excellente concordance entre IHC et BM (coefficient Kappa de Cohen à 0,85) suggère que les 2 techniques sont équivalentes pour le dépistage du phénotype dMMR, avec 7,1% de discordances. Dans 20,3% de cas, la BM donne des résultats « sous réserve » ou pas de résultats, alors que l’IHC est toujours contributive, suggérant que l’IHC est supérieure à la BM. Parmi les 13 patients atteints de SMT-SL, 2 ont un faible score de risque de la Mayo-Clinic (1 point) et n’auraient pas été dépistés par ce score. Ainsi, l’IHC a la sensibilité la plus élevée pour le dépistage du SMT-SL (100%) avec une faible spécificité, tandis qu’un score de risque de la Mayo-Clinic >2 points a une sensibilité plus faible (92%) mais une spécificité plus élevée (89%). Par ailleurs, peu d‘études sont consacrées à l’analyse du microenvironnement immun des TSs, sinon sur l’expression de marqueurs de régulation de la réponse immune (PD-1, PD-L1) et jamais au lien entre la composition de ce microenvironnement et le statut MMR. Nous avons analysé la composition de ces infiltrats en comparant les zones (massifs tumoraux, stroma intra-tumoral et tissu conjonctif péri-tumoral) avec le type histologique, reflet de l’agressivité des TSs, puis selon le statut MMR (type de protéine(s) absente(s), existence ou non d’un SMT). Nous montrons que les infiltrats immuns (Lymphocytes T CD3, Lymphocytes T cytotoxiques CD8, Lymphocytes T helpers CD4, Lymphocytes Treg FOXP3, Lymphocytes B CD20, Macrophages CD68, Macrophages de type M1 INOS, Macrophages de type M2 CD163, Cellules dendritiques CD11c), comme l’expression des molécules PD-1 et PD-L1, sont plus importants dans le stroma intra-tumoral que dans les massifs tumoraux et le tissu conjonctif péri-tumoral. Les CSs ont un infiltrat immunitaire plus dense en macrophages M2 et en DCs que les tumeurs bénignes, notamment les ASs. Dans le microenvironnement des CSs, l’expression de PD-L1 est plus importante que dans le microenvironnement des tumeurs bénignes, sans expression significative par les cellules tumorales. De plus, aucune différence dans la composition du microenvironnement des TSs a été observée selon le statut MMR, l’existence d’un SMT-SL, ou le type de protéine(s) absente(s). Pour dépister le SMT-SL, la réalisation d’un score de risque Mayo-clinique en première intention puis de l’IHC semble la meilleure stratégie avec un coût inférieur pour la société. Cette attitude doit être adaptée aux ressources médico-économiques de chaque pays. Nos données montrent aussi que la composition du microenvironnement des TSs n’est pas liée au phénotype MMR mais à l’agressivité des lésions. Au sein de ce microenvironnement, nous suggérons que les macrophages, notamment de type M2, et les DCs jouent un rôle permissif à la croissance tumorale. L’immunothérapie ciblant la liaison PD-1/PD-L1 pourrait être une bonne option thérapeutique pour les CSs.

Introduction : En réanimation, le sommeil est déstructuré, fragmenté et non réparateur. Ce mauvais sommeil est associé à une augmentation de la morbi-mortalité et de la durée du sevrage de la ventilation mécanique. Le sevrage ventilatoire est une période critique qui se complique dans 15% des cas. Les échecs de sevrage ventilatoire ont une physiopathologie complexe et le mauvais sommeil pourrait être impliqué en diminuant l’autonomie respiratoire des patients. Objectifs : (1) Evaluer l’impact de la privation de sommeil sur l’endurance musculaire inspiratoire et manuelle ; (2) Explorer les mécanismes physiologiques en cause chez le sujet sain ; (3) Evaluer chez le patient de réanimation la pertinence des mécanismes mis en évidence chez le sujet sain et proposer des mesures protectrices du sommeil en réanimation. Matériel et Méthodes : Chez le sujet sain, ce travail de thèse a comparé l’endurance inspiratoire et manuelle après sommeil normal et après privation aiguë de sommeil, en explorant la commande cérébrale musculaire, le muscle squelettique et les afférences musculaires. Chez le patient de réanimation, la commande cérébrale inspiratoire a été comparée entre les patients réussissant et les patients échouant leur sevrage ventilatoire. Enfin, la capacité d’un algorithme à distinguer les états de veille et de sommeil des patients de réanimation a été évaluée. Résultats : Une privation aiguë de sommeil diminuait l’endurance inspiratoire de 50% et manuelle de 11% chez des hommes sains. Cette perte d’endurance musculaire était associée à une altération de la commande musculaire corticale prémotrice et à une augmentation de la dyspnée et des afférences motrices pour un effort équivalent. Chez les patients de réanimation, une augmentation de 0,425 µV d’amplitude des potentiels prémoteurs inspiratoires prédisait l’échec de sevrage ventilatoire avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 87%. L’analyse automatique de polysomnographies de réanimation par un algorithme de détection automatique du sommeil était bien corrélée à la lecture humaine. Conclusions : Lors d’un exercice, la privation aiguë de sommeil entraine une augmentation des afférences musculaires, inhibant la commande prémotrice corticale et réduisant l’endurance des muscles striés squelettiques. La mesure des potentiels prémoteurs inspiratoires prédit efficacement l’échec de sevrage ventilatoire d’un patient intubé. Ainsi, le mauvais sommeil nuit au sevrage ventilatoire des patients. Mais la détection en direct du sommeil de ces patients ouvre la voie à une protection du sommeil tout au long du nycthémère.

La cancérologie est une spécialité en constante évolution avec le développement de la médecine personnalisée, ce qui nécessite de définir des biomarqueurs pronostiques et/ou prédictifs fiables et reproductibles de réponse à un traitement donné. Actuellement la recherche d’anomalies moléculaires se fait quasi exclusivement au niveau tumoral, or il est maintenant connu que les tumeurs relarguent de l’ADN circulant tumoral (ADNct), « dilué » dans l’ADN total (ADN cell free (ADNcf)). Aujourd’hui seules quelques indications d’analyses sur ADNct sont validées et remboursées en raison de conditions pré-analytiques et de techniques d’analyses très hétérogènes. Dans le cadre de ma Thèse de Sciences j’ai évalué l’ADNct comme biomarqueur prédictif dans les adénocarcinomes pancréatiques (AP) et pour le diagnostic et le suivi de l’instabilité microsatellitaire (MSI) dans les cancers colorectaux (CCR). Mon premier travail porte sur l’étude de l’ADNct et de l’ADNcf comme marqueur prédictif de réponse à la chimiothérapie (CT) de 1ère ligne chez les patients atteints d’un adénocarcinome pancréatique (AP) non résécable (étude KRASCIPANC). Pour ce cancer de mauvais pronostic, il est urgent de trouver un biomarqueur prédictif de réponse à la CT. Dans ce travail incluant 69 patients j’ai définis un score combiné associant ADNcf initial et ADNct muté KRAS à J28, hautement prédictif de réponse au traitement. Ce score combiné nécessite d’être validé sur une cohorte plus large pour ensuite développer une étude prospective de phase II avec changement précoce de CT guidé par l’ADNct. Dans la deuxième partie de ma Thèse je me suis intéressée aux cancers colorectaux avec une instabilité microsatellitaire (CCR MSI) dont la prise en charge thérapeutique est en pleine révolution avec l’efficacité majeure de l’immunothérapie (IO) dont la prescription est sous-tendue par la détermination du phénotype MSI. La réalisation de cette analyse par la technique de séquençage haut débit (Next Generation Sequencing, NGS) est importante afin de pouvoir la réaliser dans une approche « tout en un » en concomitance avec la recherche de mutation des gènes d’intérêt. Nous avons sélectionné puis testé en NGS un octaplex de microsatellites (CaBio) avec le pipeline bio-informatique MSI Detection (MSID) sur 391 tumeurs en se comparant aux 2 techniques de référence. Nous avons ainsi mis en place un test de phénotypage de MSI en NGS, l’octaplex CaBio-MSID, qui a une sensibilité de 98,4% et une spécificité de 98,4% pour les CCR. Enfin le troisième travail présenté est encore en cours et utilise l’octaplex CaBio-MSID et l’analyse en ddPCR des microsatellites du Pentaplex sur ADNct dans une population prise en charge pour un CCR MSI. Les résultats préliminaires portant sur 80 prélèvements de 31 patients ont permis de retrouver une sensibilité et une spécificité de la ddPCR-MSI respectivement de 100% et 81,8%, ces valeurs étaient de 90,9% et 100% pour la technique CaBio-MSID. La quantité d’instabilité reflétée par la fréquence allélique de MONO-27 instable semble corrélée à la réponse tumorale avec 79,2% d’ADNct-MSI détecté en ddPCR dans le groupe de patients en progression tumorale contre 50% avec la technique octaplex CaBio-MSID. Ces résultats sont à interpréter avec précautions en raison de leur caractère préliminaire, de la population faible et de plusieurs biais techniques. Ces travaux confirment l’intérêt clinique de l’ADNct dans les cancers digestifs pour déterminer en amont des évaluations radiologiques standards la réponse au traitement. Malgré les progrès des techniques de biologie moléculaire, la principale limite des travaux sur l’ADNct reste la sensibilité de détection qui mérite d’être améliorée avec également la nécessité de standardiser les techniques d’analyses sur de larges séries. Plus important encore il faut démontrer l’impact clinique de l’ADNct dans des essais prospectifs randomisés d’adaptation thérapeutique en fonction de la cinétique de l’ADNct.

Les cathéters veineux périphériques (CVP) sont un outil indispensable à la médecine moderne, rien qu’en France cela représente plus de 20 millions de CVP vendus par an. Malgré cette utilité indéniable les échecs de cathéters sont extrêmement fréquents, et responsable de désagrément pour le patient, l’équipe soignante, et le système de soins. Les causes de ces échecs peuvent être infectieuses, mécaniques ou vasculaires, et surviennent dans 35 à 50% des cas dans les études. Pour éviter ces complications, différentes stratégies existent, qu’elles soient antiseptiques, ou liées aux matériaux. Malheureusement la littérature sur le sujet ne permet pas toujours de choisir la stratégie la plus efficiente. L’objectif de ce travail était de proposer une réflexion globale sur les CVP, leurs complications, les stratégies permettant de les réduire, et l’impact de ces stratégies sur le microbiote. Nous avons d’abord comparé plusieurs antiseptiques pour les complications infectieuses des CVP, avec des résultats en faveur de la Chlorhexidine en milieu alcoolique (CHX – OH) par rapport à la Povidone iodée en milieu alcoolique (PVI - OH). Dans un second travail nous avons étudié l’Hypochlorite de Sodium (HS) en milieu aqueux, précédé ou non d’une application d’alcool. Les résultats étaient identiques en termes de colonisation, mais rapporté à la durée de cathétérisme, les complications étaient moindres dans le bras HS sans alcool. Par ailleurs les taux de colonisation (en cathéter-jours) étaient proches de ceux de la PVI-OH, appelant à d’autres études. Dans un second temps nous avons étudiés différents types de cathéters, simple ou intégrés, avec comme critère de jugement la durée de cathéterisation. Les cathéters intégrés comprenaient un cathéter avec prolongateur intégré, ailettes de stabilisation, valves bidirectionnelles avec bouchons imprégnés, et des seringues pré remplies de NaCl 0,9% pour le rinçage. Les résultats étaient en faveur des cathéters intégrés, dont l’impact sur la diminution des complications permettaient une durée de cathétérisme augmentée de près de 20 heures, en diminuant les complications de type occlusion et déplacement. Bien conscient que chaque progrès serait jugé également en fonction du cout financier, nous avons mené une étude médico-économique. Nous avons d’abord estimé le cout des différents cathéters et de leurs complications, dans notre système de soins Français. Cette phase était indispensable au vu des variabilités importantes dans la littérature internationale et l’absence de données en France. Puis nous avons utilisés ce travail pour créer une modélisation de soins qui a permis de montrer le bénéfice par patient à utiliser ces cathéters intégrés, certes plus cher de base, mais un surcout rapidement contrebalancé par l’augmentation de la durée de cathétérisme. Enfin nous avons mené une étude s’intéressant à l’impact des antiseptiques sur le microbiote cutané des patients. Cette étude a permis de montrer une modification de la représentation bactérienne engendrée, sans impact sur la diversité du microbiote. Cette modification de la représentation bactérienne n’était pas la même selon l’antiseptique utilisé. Ces études permettent une évaluation des CVP et des complications en lien, de manière globale, ce qui est indispensable au vu de la complexité des phénomènes étudiés, et du niveau d’intrication des complications. Nos résultats permettent de faire des propositions sur les stratégies à même de diminuer ces complications, tout en permettant d’économiser de l’argent pour le système de soins. Enfin, notre étude sur le microbiote, qui est la première à s’intéresser à cette problématique sous cet angle, apporte des informations nouvelles sur l’utilisation des antiseptiques, et les conséquences sur le microbiote cutané. Encore beaucoup de points nécessitent d’être explorés, via des études à venir.

Les perturbateurs endocriniens (PE) sont présents au sein de nombreux milieux et impactent la santé des populations. Les patients ayant une insuffisance rénale chronique terminal (IRCT) et plus particulièrement les patients insuffisants rénaux chroniques dialysés (IRCD) sont une population à risque car surexposée aux PE. En effet d’une part la dégradation de la fonction rénale engendre une accumulation de ces micropolluants et d’autre part certains PE sont apportés par l’eau et les dispositifs médicaux (DM) utilisés dans le cadre de leur prise en charge thérapeutique. Les objectifs de notre travail ont été d’évaluer l’exposition des patients IRCD aux PE et d’identifier les mesures de prévention visant à diminuer cette exposition. Nos premiers travaux ont permis, via une revue systématique de la littérature réalisée selon la méthodologie PRISMA de mettre en évidence que le patient IRCD était exposé à de multiples PE tels que le Bisphénol A (BPA), les dérivés chlorés du BPA (ClxBPAs), les analogues du BPA, le nonylphénol et les phtalates. Ainsi ce travail a souligné les multiples expositions du patient IRCD et la nécessité de les réduire. Nous avons par ailleurs mis au point une technique de dosage sensible et spécifique du BPA et des ClxBPAs permettant de réaliser leur dosage dans le plasma de patients IRCT selon les recommandations internationales. Cette technique a pu ensuite être utilisée dans une étude transversale, monocentrique nommée EBOLH (Exposure Bisphenol OnLine Hemodiafiltration). Ont été inclus dans cette étude : 24 volontaires sains, 35 patients en IRCT non dialysés, et 64 patients IRCD traités par hémodialyse (32 par hémodialyse conventionnelle et 32 par hémodiafiltration en ligne). Des dosages plasmatiques de BPA et de ClxBPAs ont été effectués. Nous avons mis en évidence une surexposition globale du patient IRCD, favorisée lors de l’utilisation de dialyseurs composés de polysulfone. La réalisation d’une séance de dialyse n’a en revanche pas eu d’impact significatif sur les taux de BPA retrouvés en pré et post dialyse. Parallèlement nous avons évalué la composition des circuits de cinq modèles de générateurs de dialyse et mesuré les taux de BPA relargués au sein des liquides de dialyse produit par chacun des 5 modèles. Nous avons identifié des matériaux susceptibles de contenir du BPA au sein de différents éléments qui entrent en contact avec les liquides de dialyse, notamment dans les circuits et les membranes et coques de l’ensemble des ultrafiltres. Ces résultats ont été confirmés par la mesure des concentrations de BPA au sein des différents liquides de dialyse. Nos résultats démontrent l’importance de rincer suffisamment l’ensemble du matériel avant de connecter le patient au générateur, particulièrement lorsque les ultrafiltres viennent d’être changés ou lorsque le générateur de dialyse est neuf. Enfin nous avons souhaité évaluer les connaissances, attitudes et pratiques des professionnels de santé impliqués dans le domaine de la dialyse vis-à-vis des PE. Cette étude observationnelle, transversale et multicentrique a été menée via la diffusion d’un questionnaire aux médecins, pharmaciens et infirmiers exerçant dans différents services de dialyse en France. Quatre-vingt-trois professionnels de santé de la dialyse ont participé à notre enquête. Elle aura permis d’apporter des connaissances aux professionnels, de les sensibiliser à cette thématique et ainsi de participer dans la pratique à la diminution de l’exposition du patient au cours des soins de dialyse. Notre travail aura donc permis une avancée conséquente sur l’évaluation de l’exposition des patients IRCD aux PE et a permis d’identifier des mesures de prévention permettant de diminuer cette exposition dans la pratique de l’hémodialyse.

L’ischémie-reperfusion est un phénomène physiopathologique complexe, indissociable de la transplantation rénale, et induisant des lésions pouvant conduire à la dysfonction de l’organe à court et moyen terme et potentiellement à sa perte. Les reins issus de donneurs décédés après arrêt circulatoire ainsi que ceux issus de donneurs à critères étendus, dont l’utilisation ne fait qu’augmenter, sont des greffons particulièrement sensibles à ces lésions ; parmi les stratégies visant à contrôler celles-ci, notre étude vise à tester une thérapie cellulaire innovante basée sur des exosomes dérivés de Cellules Progénitrices Urinaires porcines (pUPCs) combinée à une perfusion hypothermique en machine de perfusion (HMP) suivie d’une perfusion normothermique ex vivo en machine de perfusion (NMP). Les pUPCs ont été isolées et caractérisées par cytométrie en flux, immunofluorescence et western blotting. Les exosomes dérivés de pUPCs ont été isolés par ultracentrifugation et caractérisés par western blotting, microscopie électronique et par nanotracking assay. Les reins porcins, prélevés à l’abattoir, ont été soumis à 32 min d’ischémie chaude puis conservés en HMP pendant 24 heures à 4°C. Par la suite, les reins ont été perfusés ex vivo en normothermie oxygénée durant 5h à 37°C. Pour la thérapie cellulaire, des exosomes dérivés de pUPCs (Exo) ont été injectés via l’artère rénale porcine. Trois groupes expérimentaux ont été réalisés (n = 5-6/groupe) : Groupe 1 : HMP/véhicule + NMP/véhicule, Groupe 2 : HMP/Exo + NMP/véhicule, Groupe 3 : HMP/Exo + NMP/Exo. Les analyses effectuées comprennent notamment des paramètres fonctionnels et histologiques, les analyses de l’expression des protéines/cytokines dans les perfusats ainsi que l’effet des perfusats sur des cultures de cellules aortiques porcines in vitro. Tout d’abord, les pUPCs ont été isolées et amplifiées à partir d’échantillons d’urine porcine. Les pUPCs isolées expriment des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses comme CD90 et sont négatives pour CD31 (marqueur endothélial) et CD45 (marqueur de cellules souches hématopoïétiques). Les pUPCs ont la capacité d’acquérir un phénotype épithélial (expression d’E-cadhérine) après différenciation en cellules tubulaires avec la présence de transporteurs d’eau (AQP1 et AQP2). Les exosomes dérivés de pUPCs expriment des marqueurs exosomaux Alix et TSG101, ont une taille attendue (30-100 nm de diamètre) et sont délimités par une double membrane. L'injection d'exosomes dérivés de pUPCs pendant 24 heures de HMP est faisable, n’impactant pas négativement les paramètres de perfusion, mais aucune différence significative n'a été montrée (analyse en fin de HMP). L'injection d'exosomes pendant la NMP est également possible et n'a pas d'impact significatif sur le débit de perfusion, la résistance rénale, la consommation d'oxygène, la prise de poids des reins, la production d'urine, la fonction rénale (créatinine et sa clairance) et le niveau d'ATP. Cependant, certains marqueurs de lésions cellulaires sont diminués dans le Groupe 3 (ASAT, LDH) et les analyses des perfusats de NMP montrent que l’injection d’Exo induit une immunomodulation (diminution des cytokines pro-inflammatoires (IL1α, IL1β, IL8) et augmentation de la cytokine anti-inflammatoire IL1RA). In vitro, la présence d’exosomes au sein des perfusats permet d’augmenter l’activité mitochondriale de cellules endothéliales porcines en culture. Des analyses métabolomiques et transcriptomiques sont en cours afin de comprendre le mécanisme d’action de ces vésicules. Cette étude montre la faisabilité et l’intérêt potentiel d’utiliser des exosomes dérivés de pUPCs pour le conditionnement du greffon rénal ex vivo. Ces résultats doivent être évalués sur un modèle de transplantation rénale porcine.

Le Virus West Nile (WNV) est un flavivirus neurotrope émergent contre lequel il n’existe ni traitement ni vaccin. Transmis à l’Homme lors du repas sanguin du moustique vecteur, le virus est inoculé dans la peau où il infecte les kératinocytes de l’épiderme. L’arsenal défensif du kératinocyte humain inclut la synthèse de 9 peptides antimicrobiens dont l’activité contre le WNV n’a jusqu’ici jamais été étudiée. Au cours de ce travail, nous avons évalué les propriétés antivirales et immunomodulatrices de la cathélicidine humaine LL-37, de la bêta-défensine humaine de type 3 (hBD-3) et de deux peptides de la famille S100, la psoriasine S100A7 et la calprotectine S100A8/A9. Nos résultats ont montré une activité antivirale directe de la LL-37, à forte concentration (10 µg/mL), se traduisant par une réduction de la charge virale dans le surnageant des kératinocytes infectés et du titre infectieux d'un inoculum viral incubé en présence du peptide. En revanche, le traitement par hBD-3 n’a pas eu d’impact significatif sur l'infection par le WNV aux concentrations testées. Par ailleurs, une augmentation significative de l’expression de plusieurs marqueurs inflammatoires aux niveaux transcriptomique et protéique a été observée en présence de chacun des deux peptides par rapport aux cellules stimulées par un ARN bicaténaire de synthèse, le poly (I:C), ou infectées par le WNV en leur absence. Dans la seconde partie de ce travail, les expérimentations menées avec les peptides S100A7 et S100A8/A9 se sont révélées décevantes. L’apport exogène des peptides au cours de l’infection de kératinocytes ou le recours à des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer les peptides d’intérêt n’a montré aucun impact significatif sur la réplication du WNV. En complément, aucun effet virucide des peptides S100 à la concentration de 10 µg/mL ni immunomodulateur n’a été observé. En conclusion, ces résultats suggèrent un effet antiviral indirect de la LL-37 et d’hBD-3 par potentialisation de la réponse immunitaire innée du kératinocyte à l’infection. Ces propriétés immunomodulatrices viendraient s’ajouter, pour la LL-37, à une action directe par altération de la particule virale. En revanche, les peptides de la famille S100 ne semblent pas avoir de rôle antiviral majeur dans la réponse antivirale du kératinocyte à l’infection par le WNV. De façon générale, ce travail souligne les potentialités antivirales, encore méconnues, des molécules produites par la peau et les kératinocytes à la porte d'entrée et au site initial de réplication du WNV et des arbovirus dans l'organisme.