UPThèses

La mucoviscidose résulte de la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) induisant un défaut de sécrétion des ions chlorure à la membrane apicale des épithéliums respiratoires, digestifs et reproducteurs. L'objectif de ce travail était de caractériser des molécules capables de restaurer une sécrétion chlorure dans des modèles mucoviscidosiques in vitro, ex vivo et in vivo. Dans un premier temps, nous avons identifié deux composés de la famille des adduits méthylglyoxalalpha-aminoazahétérocycle (ie le GPact-11a et le GPact-26a) comme activateurs non-toxiques et hydrosolubles des CFTR sauvages et F508del. Dans une seconde partie de l'étude, nous avons identifié un nouvel activateur des canaux TRPC6 : le guanabenz. Nous avons mis en évidence que le guanabenz induit l'activation des canaux chlorures calcium-dépendant (CaCC) via une entrée de calcium extracellulaire par le canal TRPC6. La restauration de la sécrétion chlorure grâce à l'activation du F508del-CFTR ou du CaCC représente une approche pharmacologique efficace et mesurable pour le traitement de la mucoviscidose. De plus, l'identification d'une nouvelle voie d'activation du CaCC via TRPC6 représente une avancée scientifique pouvant se répercuter sur d'autres pathologies.

Le calcium est un messager intracellulaire secondaire impliqué dans le contrôle de nombreux processus biologiques. Un mauvais contrôle de sa concentration peut conduire à la mort cellulaire. Pour ce faire, le Ca2 + est stocké dans les compartiments intracellulaires tel que le réticulum endoplasmique (RE). La mucoviscidose (CF) est une maladie génétique résultant de la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Chez une majorité de patients (92%), il est retrouvé une délétion d'un résidu phénylanine en position 508. La protéine ainsi délétée (F508del-CFTR) se retrouve retenue dans le RE par des protéines chaperonnes dépendantes du Ca2 + Dans un premier temps, nous avons caractérisé et comparé l'homéostasie calcique des cellules épithéliales CF et non FC, précisément au niveau : du ER, de la membrane plasmique et pour finir au niveau des mitochondries. Puis, nous avons regarder les conséquences sur l'homéostasie calcique de la correction du défaut de l'adressage défectueux de la protéine F508del-CFTR (correction pharmacologique ( miglustat) ou par une incubation 24 heures à 27 ° C) . Nous avons mis en évidence l'implication de 3 isoformes de recepteurs à l'IP3 (RIP3),des canaux calciques membranaires TRPC1 et TRPC6, ainsi qu'une participation des mitochondries. Dans la mucoviscidose, les RIP3s, les canaux TRPC6 apparaissent suractivés. Il semble que le contenu en cholestérol de la membrane plasmique joue un rôle primordial dans la régulation du TRPC6. tandis que le pouvoir tampon calcique des mitochondries apparaît diminué dans les cellules CF. Le contrôle du signal calcique des cellules mucovisidosiques apparaît fortement perturbé. Ces perturbations du signal calcique pourraient avoir de nombreuses implications dans la physiopathologie de la mucoviscidose, notamment au niveau de l'état inflammatoire des cellules mucoviscidosiques.

De nombreuses maladies génétiques sont directement liées à la reconnaissance de protéines mal repliées par le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur rétrotranslocation vers le cytosol puis leur dégradation. Dans le cas des glycoprotéines mutées, comme la protéine F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la démannosylation extensive de leur résidus mannoses constitue une étape clé dans ce processus. L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des molécules capables de rétablir l’expression membranaire de F508del-CFTR en ciblant cette activité enzymatique. Dans un premier temps, nous avons testé des dérivés multivalents basés sur le Deoxymannojirimycin (DMJ), un inhibiteur spécifique de la classe I des α-mannosidases et révélé leur effet correcteur puissant sur F508del-CFTR. Nous avons par la suite mis en évidence leur mécanisme d’action et tenté d’expliquer l’augmentation d’efficacité observée entre les monovalents et les multivalents. Nous nous sommes enfin focalisés sur le rôle des principales mannosidases dans le RE, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) et la famille des lectines EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein). Nous avons montré par une stratégie de siRNA qu’ERManI, EDEM1 et EDEM2 sont impliquées dans la rétention réticulaire du F508del-CFTR. Notre étude ouvre ainsi de nouvelles perspectives quant à l’identification de nouveaux agents pharmacologiques ciblant ces protéines.

La protéine transmembranaire CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), impliquée dans la mucoviscidose est un canal chlorure régulée par l'ATP et l'AMPc. Les mécanismes de régulation des processus d'ouverture/fermeture du canal ne sont pas encore clairement démontrés mais depuis quelques années, les nouvelles données sur la structure moléculaire de la protéine ont permis des avancés dans ce domaine. Les objectifs de ce travail de recherche ont été de caractériser, par une étude de relation structure/fonction, le rôle de l'extrémité C-terminale du NBD1 et de son environnement moléculaire dans la régulation de la maturation ou de l'activité du canal ainsi que dans sa pharmacologie. Certains résidus déterminés par l'exploration des modèles moléculaires ont été mutés par mutagenèse dirigée puis les conséquences de ces mutations ont été analysées par les techniques de western blot, de patch clamp et d'efflux d'iodure. Nos travaux ont permis de mettre en évidence l'importance de l'intégrité de la structure en épingle à cheveux de l'extrémité C-terminale du NBD1 ainsi que de ses différentes liaisons, dans la maturation et l'activité du canal. Concernant le mécanisme d'action des composés MPB, composés à double action (activateur et correcteur de CFTR), nous avons montré que la perturbation directe de la structure de la β-hairpin rendait l'action des composés impossible alors que la perturbation de la liaison avec le Walker A du NBD2 induisait une meilleure action des MPB. Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence un rôle important de l'extrémité C-terminale du NBD1 dans la régulation de l'adressage, de l'activité et de la pharmacologie du canal CFTR.