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64 - Biochimie et biologie moléculaire

Les thèses se rapportant à la section CNU "64 - Biochimie et biologie moléculaire"

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  • Implication des interactions Quorum Sensing dépendantes dans la mise en place et la prévalence des co-infections et la virulence de B. afzelii et B. garinii, agents responsables de la Borréliose de Lyme en Europe    - Alafaci Aurélien  -  16 décembre 2021

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    La Borréliose de Lyme est la maladie vectorielle la plus importante dans l’hémisphère nord en termes de prévalence. Elle est causée par des bactéries du genre Borreliella qui sont transmises à l’Homme par l’intermédiaire de morsures de tiques. En Europe, B. afzelii et B. garinii sont deux espèces majeures qui sont fréquemment co-détectées au sein d’une tique, soulevant l’hypothèse de l’existence d’un système leur permettant d’établir des co-infections. Le Quorum Sensing est un système de communication bactérien qui joue un rôle crucial dans le cycle de vie et la virulence des bactéries. Le Quorum Sensing induit par l’autoinducteur-2 (AI-2) permet une communication à la fois intra et inter-espèces. L’un des objectifs de cette thèse a été d’investiguer la présence, la fonctionnalité et le rôle de ce type de communication chez B. afzelii et B. garinii. Les résultats ont montré que ces deux espèces possèdent un système de communication AI-2 dépendant fonctionnel. Le développement d’outils visant à bloquer cette communication a été initié et permettra d’étudier de manière plus précise le rôle du Quorum Sensing dans la virulence des Borreliella ainsi que dans l’établissement de co-infections. En parallèle, la présence de tiques infectées par des Borreliella en Poitou-Charentes a été étudiée pour la première fois. Pour cela, le microbiote bactérien interne de tiques Ixodes ricinus a été étudié par séquençage haut-débit d’amplicons du gène codant l’ARNr 16s. Cette méthode présente l’avantage de permettre la caractérisation du microbiote bactérien dans son ensemble, à la fois les pathogènes mais également les autres genres bactériens. Un microbiote conservé/partagé des tiques analysées a été défini et la présence de séquences assignées à Borreliella spp. a été mise en évidence. Au sein de plusieurs tiques, différentes espèces de Borreliella spp. ont été détectées, indiquant de possibles co-infections.

  • Etude de l'état viable non cultivable (VBNC) chez Legionella pneumophila Lens après traitements monochloramine et thermique    - Alleron Laëtitia  -  08 février 2008

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    Legionella pneumophila, l'agent responsable d'une pneumonie sévère atypique chez l'homme, appelée maladie du légionnaire, est ubiquitaire dans les environnements aquatiques. Les traitements généralement appliqués dans les réseaux d'eau afin d'éradiquer cette bactérie sont souvent suivis d'une recolonisation rapide de cette bactérie. Un des facteurs pouvant expliquer cette recolonisation peut être l'état Viable Non Cultivable (VBNC).L'objectif de nos travaux a été d'étudier la survie de L.pneumophila après des traitements oxydant et thermique et notamment d'étudier l'état VBNC. Dans un premier temps nous avons réalisé un traitement monochloramine et un traitement thermique sur une suspension de légionelles. Nous avons observé que le traitement par 20 mg/L de monochloramine ainsi que celui à 57,5°C, conduisaient à la formation de VBNC chez L. pneumophila. De plus ces bactéries peuvent persister dans cet état pendant au moins 169 jours après traitement.Dans un second temps, une étude partielle des protéines exprimées à l'état VBNC a été menée. Nous avons montré que l'expression de plusieurs protéines, impliquées dans les voies de production d'énergie, de synthèse protéique et dans la virulence, était augmentée d'un facteur supérieur ou égale à deux par comparaison avec des bactéries ayant subies un stress monochloramine ou une carence en nutriments.Dans un troisième temps, la recherche d'un facteur de ressuscitation Rpf a été entreprise chez L. pneumophila. Un gène Rpf-like, possédant 33% d'identité et 51% de similarité avec celui de Salmonella, a été découvert. Ce gène a été cloné mais la protéine recombinante obtenue n'a pas conduit à un retour à la cultivabilité des cellules.

  • Impact de la multiplication chez l'hôte Acanthamoeba castellanii sur le développement de biofilms chez Legionella pneumophila    - Bigot Renaud  -  12 décembre 2013

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    Legionella pneumophila est une bactérie intracellulaire facultative retrouvée aussi bien dans les environnements aqueux naturels qu'artificiels. Cette bactérie est l'agent de la légionellose, une pneumopathie sévère. Les milieux aqueux sont colonisés par des biofilms, une association de micro-organismes enveloppés d'une matrice exopolymérique. Les légionelles sont capables de coloniser et de survivre au sein de ces biofilms. Dans les réseaux d'eaux, les biofilms sont la cible de la prédation des amibes qui se retrouvent ensuite parasités par les légionelles et favorisent ainsi leur multiplication. Nous avons étudié l'impact de l'origine de la multiplication des légionelles sur la colonisation et la formation de biofilms. Notre étude a démontré que dans tous les cas les légionelles sont présentes à la surface de biofilms préformés. Notre étude a mis en évidence que les légionelles issues de la multiplication au sein d'amibes sont capables de former des agrégats compacts empaquetés dans une matrice exopolysaccharidique. Ce phénotype « biofilm » se manifeste après induction par une molécule amibienne en cours de caractérisation. De plus, notre étude a mis en évidence l'existence d'un nouveau système de communication de type Quorum Sensing permettant une communication inter et intra-espèce qui permet l'induction de ce phénotype chez les légionelles.

  • Occurrence des légionelles dans les eaux thermales tunisiennes et évaluation de l'activité anti-legionella des huiles essentielles de plantes autochtones    - Chaftar Nawel  -  06 novembre 2013

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    L'environnement des stations thermales est favorable à la croissance des Legionella. La Tunisie compte de nombreux sites thermaux. Elle a par ailleurs développé une médecine traditionnelle à base de plantes. L'objectif de ce travail était de caractériser des souches de légionelles isolées de stations thermales et d'étudier le potentiel antimicrobien d'HE de plantes tunisiennes. 2 souches de L. londiniensis et 16 de L. pneumophila (sérovars 1, 4, 5, 6 et 8) ont été isolées de 3 stations thermales tunisiennes et avaient des pulsotypes différents de ceux de la base du CNRL. Les HE de 6 plantes tunisiennes ont été extraites, analysées (GC-MS) et testées contre L. pneumophila (8 souches, sérovars 1, 4, 5, 6 et 8). Les HE de Juniperus phoenicea L. (isobornéol 20,91% et 1S α-pinène 18,30%) et Thymus vulgaris (carvacrol 88,50%) étaient les plus actives (CMI <0,03 mg/mL et ≤0,07 mg/mL respectivement). L'activité de 20 HE (6 de plantes tunisiennes et 14 commerciales) a été évaluée contre 11 espèces bactériennes (6 Gram+, 5 Gram-) et 7 fongiques (4 levures, 3 filamenteux). L'HE de T. vulgaris tunisien était la plus active (Gram-: CMI ≤0,34 mg/mL ; Gram+: CMI ≤0,7 mg/mL ; levures: CMI ≤0,55 mg/mL ; moisissures: CMI=0,3 mg/mL ; dermatophytes: CMI ≤0,07 mg/mL). Elle a montré une activité très supérieure à celle de l'HE commerciale de T. vulgaris certainement due à sa composition différente. En conclusion, la présence de Legionella dans les sites étudiés doit encourager les autorités à renforcer les mesures préventives et l'efficacité antimicrobienne des HE, en particulier l'HE de T. vulgaris tunisien, suggère leur possible intérêt dans le traitement des eaux ou la conservation des aliments.

  • Identification et caractérisation de composés produits par des bactéries environnementales pour la lutte biologique contre Legionella pneumophila    - Corre Marie-Hélène  -  10 décembre 2018

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    Les circuits et réseaux d’eau subissent épisodiquement des problèmes de contamination par des microorganismes tels que Legionella pneumophila, conduisant à la dégradation de la qualité microbiologique de l’eau circulante. De nouveaux moyens de traitements doivent être mis en place de façon notamment à limiter l’usage de biocides chimiques. Ce travail de thèse s’inscrit dans cette problématique et a pour objectif d’identifier de nouveaux composés actifs contre L. pneumophila en tenant compte de son comportement et de ses interactions au sein de son microenvironnement. De manière à obtenir des composés produits par des souches bactériennes appartenant à la même niche écologique que L. pneumophila, une campagne de prélèvement d’eau a été réalisée. Un total de 273 isolats environnementaux ont été isolés et testés contre L. pneumophila. Les résultats obtenus indiquent que 178 de ces isolats (65%) présentent une activité anti-Legionella. Quatre souches ont ensuite été sélectionnées (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52 et Pseudomonas spp PW329) et les composés actifs produits ont été caractérisés. A. bestiarum SW257 produit un peptide anti-Legionella. Flavobacterium sp. PW52 produit un mélange de composés anti-Legionella ayant des propriétés tensioactives, les flavolipides. Pseudomonas sp. PW329 produit des composés organiques volatiles, identifiés par SPME-GC-MS, actifs contre L. pneumophila. Enfin, R. aquatilis SW265 produit un sidérophore à activité anti-Legionella.

  • Diversité et implication des amibes libres dans la survie et la persistance des mycobactéries non tuberculeuses au sein d'un réseau d'eau potable    - Delafont Vincent  -  21 octobre 2015

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    Les amibes libres sont des microorganismes unicellulaires eucaryotes dont l'écologie au sein des réseaux d'eau potable est mal connue. Les amibes libres représentent un enjeu de santé publique, du fait de leur capacité à favoriser la présence de bactéries potentiellement pathogènes, parmi lesquelles des mycobactéries. Une campagne de prélèvement menée sur le réseau d'eau potable de Paris a permis d'évaluer la diversité des amibes libres et de leur microbiome bactérien, par pyroséquençage ciblant les gènes ribosomaux (16S et 18S). Ces analyses ont suggéré la prédominance des genres Acanthamoeba, Vermamoeba, Echinamoeba et Protacanthamoeba. Le microbiome des amibes a révélé une grande diversité bactérienne, dominée par Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bradyrhizobium, Sphingomonas et Pseudoxanthomonas. L'intégration des paramètres physicochimiques a permis de suggérer l'importance de l'origine de l'eau, la température, le pH et la concentration en chlore dans la dynamique des populations amibiennes. Une endosymbiose originale entre V. vermiformis et des bactéries du phylum TM6 a également été mise en évidence. Les amibes ont été fréquemment co-isolées avec des mycobactéries dans le réseau, principalement les espèces M. llatzerense et M. chelonae. Des expériences d'infection chez A. castellanii ont permis d'observer la capacité de ces mycobactéries à survivre et croitre en présence d'amibes. Par génomique comparative et analyses transcriptomiques, plusieurs facteurs de virulence, conservés entre M. llatzerense, M. chelonae et M. tuberculosis, ont été identifiés et sont surexprimés au cours de l'infection. Ces données suggérent leur implication dans la résistance à la prédation amibienne. L'ensemble de ces travaux a permis d'améliorer la connaissance des populations amibiennes et de leur microbiome au sein du réseau d'eau potable, apportant des éléments supplémentaires concernant leur implication dans la survie et la persistance des mycobactéries.

  • Association légionelles-amibes et traitements biocides pour les circuits de refroidissement    - Dupuy Mathieu  -  25 novembre 2013

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    Legionella est une bactérie pathogène, ubiquitaire des environnements aqueux. L'utilisation des eaux de surface, par les centrales nucléaires, provoque un réchauffement de ces eaux, qui associé aux conditions de fonctionnement peut entraîner sa prolifération. Afin de limiter le développement de cette bactérie, en deçà des seuils réglementaires, EDF met en œuvre un traitement à la monochloramine dans ses circuits. Notre étude a eu pour but d’améliorer les connaissances sur les associations entre les légionelles et leur principal hôte : les amibes, et sur les facteurs susceptibles d’influencer leur sensibilité au traitement biocide. Nous avons, tout d’abord, mis en évidence la permissivité de 12 souches d’amibes à 2 souches de L. pneumophila. La température est apparue comme le paramètre le plus influant, la prolifération de Legionella semble favorisée à 40°C. Puis, nous avons cherché à développer un protocole pour séparer Legionella selon son état d’association. Ce protocole n’est pas abouti à l’heure actuelle. Finalement, nous avons comparé la sensibilité, de Legionella, dans différents états physiologiques et étudié l’impact de la qualité de l’eau et des MES. Les cellules post-amibes et dans une moindre mesure, les cellules en phases stationnaires sont les moins sensibles. L’effet de la matrice a été mis en évidence pour l’eau de Vienne, par contre la sensibilité n’a pas été modifiée suite à l’élimination ou l’enrichissement en MES. Cette étude constitue une base de connaissances nouvelles pour orienter les choix de gestion du traitement anti-Legionella à la monochloramine et d’exploitation des circuits.

  • Mise en place de modèle de microbiotes intestinal et cutané in vitro pour l'étude de leur interaction avec les xénobiotiques    - Écale Florine  -  12 février 2021

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    Les microbiotes intestinal et cutané humains sont deux écosystèmes stables et propres à chaque individu. Néanmoins, il existe dans chacun d’eux, un socle de souches communes, le core microbiote. De nombreux facteurs exogènes, comme les xénobiotiques, peuvent perturber et influencer la composition des microbiotes et provoquer une dysbiose, pouvant participer à plusieurs pathologies. En outre, ces microorganismes peuvent métaboliser, voire dégrader ces composés les rendant ainsi inactifs. Il est donc important de pouvoir mettre en évidence les effets potentiels des xénobiotiques sur les bactéries mais également d’identifier les souches responsables de la métabolisation des composés. Les buts de la thèse ont été la mise en place de modèle de microbiote intestinal et cutané, tout d’abord en individualisant les souches, puis en les regroupant en consortium afin de déterminer i- les effets de différents xénobiotiques sur les microbiotes et ii- l’impact de ces microbiotes sur les molécules testées. Un modèle représentatif du core microbiote intestinal composé de 30 souches ainsi qu’un modèle d’étude des souches individuelles a été en réalisé en microplaque dans un milieu unique. Les résultats ont montré que la croissance des 36 souches en culture unique ainsi que le consortium stabilisé de 30 souches est inhibée majoritairement en présence d’antibiotiques. L’analyse des surnageants de culture (souches uniques ou consortium) par UHPLC-MS/MS a, quant à elle, révélé que des xénobiotiques peuvent être modifiés chimiquement par les bactéries. Concernant le modèle cutané, nous avons mis en évidence que les parabènes n’ont pas d’action sur les staphylocoques du microbiote cutané mais que des modifications de structure de ces perturbateurs endocriniens sont retrouvés en présence de nombreuses souches bactériennes. Sur la base de nos résultats, ce modèle simplifié pourrait permettre à terme de faciliter l’étude de l’impact des xénobiotiques sur certains microbiotes, facilitant certaines étapes du développement de nouvelles thérapies.

  • Études moléculaire et cellulaire des mutations du gène CFTR : de la génétique à la fonctionnalité de la protéine    - El-Seedy Ayman-Salah-Ahmed  -  17 février 2011

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    La mucoviscidose est la maladie génétique grave à transmission autosomique récessive la plus fréquente dans les populations d'origine européenne. Cette pathologie est due au dysfonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), canal chlorure présent à la membrane apicale des cellules épithéliales. La gravité de la pathologie dépend de la ou des mutations du gène CFTR. L'objectif de nos travaux est de comprendre l'impact des mutations du gène CFTR afin d'établir un conseil génétique avisé. Pour cela, nous avons dans un premier temps déterminé quelles sont les mutations présentes sur l'exon 9 du gène. A cause de la présence de copies de cette région, nous avons établi de nouvelles conditions expérimentales pour étudier exclusivement le gène, et ainsi deux pseudomutations ont été détectées. Dans un second temps, nous avons étudié trois allèles complexes contenant des mutations fréquentes de CFTR (D443Y, G576A, R668C) et une mutation rare, G149R. In vitro nous avons mis en évidence l'effet délétère de G149R seule ou en complexe, et la diminution de la quantité de la protéine mature lorsque les autres allèles complexes sont présents. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons mis en place au laboratoire les techniques d'étude de l'épissage. Pour cela, nous avons construit un minigène hybride qui nous permet de définir le rôle exact des substitutions nucléotidiques sur l'épissage alternatif. Les résultats obtenus à partir de ces trois études nous ont permis de mieux comprendre l'impact des mutations étudiées et ainsi d'émettre un diagnostic moléculaire documenté.

  • Étude de la survie des légionelles et de la dynamique des populations microbiennes des réseaux d'eau chaude : rôle des procédés de décontamination    - Farhat Maha  -  21 octobre 2009

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    Legionella est la bactérie à Gram négatif identifiée dans les épidémies de légionellose liées à la contamination des réseaux d'eau chaude et des tours aéroréfrigérantes. En France, où la maladie est soumise à déclaration obligatoire depuis 1987, plus un millier de cas sont recensés par an parmi lesquels 10 % s'avèrent mortels. Associée à un consortium des cellules microbiennes, Legionella se trouve attachée aux surfaces dans une matrice de polymères organiques et minéraux appelée biofilm. Dans cette structure, elle devient plus résistante aux procédés de désinfection que lorsqu'elle est sous forme libre. C'est dans ce contexte qu'ont été définis les objectifs de ce travail qui s'est articulé autour trois volets principaux : (1) le développement d'un outil analytique permettant l'étude de la dynamique des populations microbiennes dans l'eau et dans le biofilm d'un réseau d'eau chaude après différents traitements anti-Legionella, (2) le suivi de l'évolution de la flore totale procaryote et de Legionella en particulier dans l'eau et le biofilm après un traitement par choc thermique (70 °C pendant 30 minutes) et par un traitement chimique (biocide combiné à un biodispersant) et (3) la caractérisation de la diversité de Legionella dans le biofilm en relation avec la dynamique de la structure microbienne (bactérie et eucaryotes) du biofilm après ces deux traitements. Un pilote à l'échelle 1 constitué de deux boucles d'eau chaude similaires (boucles témoin et test) a été développé et contaminé par un biofilm naturel de Legionella. Les deux traitements testés (thermique et chimique) ont eu un effet transitoire. Un retour aux concentrations initiales en Legionella cultivables dans l'eau et dans le biofilm a été observé une semaine après l'application des traitements. Pour une des premières fois dans ce type d'études, l'utilisation de méthodes moléculaires de pointe (séquençage, SSCP) ont permis d'identifier la diversité de Legionella (cinq espèces dont quatre sont des pathogènes opportunistes) dans le biofilm des réseaux d'eau chaude et de caractériser la flore microbienne qui accompagne Legionella dans cette matrice (protéobactéries, amibes, flagellés, champignons, alvéolates). Ce travail apporte ainsi des éléments novateurs en termes d'outils permettant de tester les traitements anti- Legionella, de méthodes analytiques et de connaissance sur le consortium microbien qui accompagne Legionella dans le biofilm.

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