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64 - Biochimie et biologie moléculaire

Les thèses se rapportant à la section CNU "64 - Biochimie et biologie moléculaire"

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  • Multiples conséquences physiopathologiques de mutations et d'allèles complexes du gène CFTR : l'importance des études génétique, moléculaire, cellulaire & in silico dans la détermination de l'impact de ces variations sur l'épissage et la protéine    - Farhat Raëd  -  03 juillet 2014

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    La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies rares chez la population caucasienne. Cette maladie héréditaire récessive est causée par des mutations du gène Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) qui code pour une protéine localisée au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. La sévérité du phénotype est déterminée par les classes des mutations et leurs combinaisons en trans, ainsi que par la présence d'allèles complexes. La détermination des effets d'une mutation est essentielle pour avoir une corrélation génotype/phénotype correcte, donner un diagnostic prénatal adapté et permettre aux cliniciens de prescrire le traitement approprié à chaque mutation quand celui-ci sera disponible. Pour cela, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations qui intéressent le laboratoire : c.1392G>T (p.Lys464Asn), c.3909C>G (p.Asn1303Lys) et c.965T>C (p.Val322Ala). L'effet de ces mutations sur la protéine a été évalué. De plus, l'impact sur l'épissage aberrant des deux premières mutations, seules et dans le cadre de leurs allèles complexes, a été déterminé. Nous avons montré que : 1) la mutation c.1392G>T est de classe V et II et son allèle complexe aggrave l'épissage aberrant, 2) la mutation c.3909C>G appartient à la classe II et l'effet sur l'épissage résulte de son allèle complexe et 3) la mutation familiale c.965T>C est un simple polymorphisme. Ces travaux montrent l'importance de l'étude d'une mutation à différents niveaux cellulaires par l'intermédiaire des analyses in silico, in cellulo et in vivo et soulignent l'effet des allèles complexes qui peuvent moduler l'impact de la mutation seule.

  • Impact de la multiplication chez l'hôte Acanthamoeba castellanii sur le développement de biofilms chez Legionella pneumophila    - Bigot Renaud  -  12 décembre 2013

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    Legionella pneumophila est une bactérie intracellulaire facultative retrouvée aussi bien dans les environnements aqueux naturels qu'artificiels. Cette bactérie est l'agent de la légionellose, une pneumopathie sévère. Les milieux aqueux sont colonisés par des biofilms, une association de micro-organismes enveloppés d'une matrice exopolymérique. Les légionelles sont capables de coloniser et de survivre au sein de ces biofilms. Dans les réseaux d'eaux, les biofilms sont la cible de la prédation des amibes qui se retrouvent ensuite parasités par les légionelles et favorisent ainsi leur multiplication. Nous avons étudié l'impact de l'origine de la multiplication des légionelles sur la colonisation et la formation de biofilms. Notre étude a démontré que dans tous les cas les légionelles sont présentes à la surface de biofilms préformés. Notre étude a mis en évidence que les légionelles issues de la multiplication au sein d'amibes sont capables de former des agrégats compacts empaquetés dans une matrice exopolysaccharidique. Ce phénotype « biofilm » se manifeste après induction par une molécule amibienne en cours de caractérisation. De plus, notre étude a mis en évidence l'existence d'un nouveau système de communication de type Quorum Sensing permettant une communication inter et intra-espèce qui permet l'induction de ce phénotype chez les légionelles.

  • Les processus de différenciation et la résistance des kystes aux traitements de désinfection chez l'amibe libre Vermamoeba vermiformis    - Fouque Emilie  -  09 décembre 2013

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    V. vermiformis est une amibe libre répandue dans l'environnement et les milieux artificiels comme les réseaux d'eau chaude sanitaire (RECS). Il est maintenant bien établi qu'elle joue un rôle de réservoir pour des bactéries pathogènes, comme L. pneumophila. Le contrôle de V. vermiformis dans les RECS représente donc un enjeu sanitaire important. Les amibes libres peuvent passer d'une forme métaboliquement active (trophozoïte) à une forme de résistance, le kyste, lorsque les conditions sont défavorables ce qui leur confère une résistance aux traitements. Malgré la haute prévalence de V. vermiformis dans les RECS, les processus de différenciation et la résistance de ses kystes aux traitements n'ont été que peu étudiés. Nous avons donc investigué les changements morphologiques et ultrastructuraux qui s'opèrent lors de l'enkystement et désenkystement de V. vermiformis. Il en ressort que l'enkystement est un phénomène rapide (9 h) qui conduit à la formation de kystes entourés d'une paroi double couche. Lors du désenkystement, les trophozoïtes n'émergent pas à travers un ostiole comme c'est le cas chez Acanthamoeba. Puis, nous avons étudié l'effet des conditions environnementales et de la concentration cellulaire sur l'enkystement. Nous avons observé que plus la concentration cellulaire est élevée plus l'enkystement est rapide, ce qui suggère l'existence de mécanismes de communication intercellulaire. Enfin, nous avons étudié la résistance des kystes aux traitements utilisés dans les RECS et aux protéases. Ces traitements étaient efficaces, in vitro, pour inactiver les kystes de V. vermiformis. Ces travaux ont permis d'apporter des connaissances de bases sur les processus de d

  • Association légionelles-amibes et traitements biocides pour les circuits de refroidissement    - Dupuy Mathieu  -  25 novembre 2013

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    Legionella est une bactérie pathogène, ubiquitaire des environnements aqueux. L'utilisation des eaux de surface, par les centrales nucléaires, provoque un réchauffement de ces eaux, qui associé aux conditions de fonctionnement peut entraîner sa prolifération. Afin de limiter le développement de cette bactérie, en deçà des seuils réglementaires, EDF met en œuvre un traitement à la monochloramine dans ses circuits. Notre étude a eu pour but d’améliorer les connaissances sur les associations entre les légionelles et leur principal hôte : les amibes, et sur les facteurs susceptibles d’influencer leur sensibilité au traitement biocide. Nous avons, tout d’abord, mis en évidence la permissivité de 12 souches d’amibes à 2 souches de L. pneumophila. La température est apparue comme le paramètre le plus influant, la prolifération de Legionella semble favorisée à 40°C. Puis, nous avons cherché à développer un protocole pour séparer Legionella selon son état d’association. Ce protocole n’est pas abouti à l’heure actuelle. Finalement, nous avons comparé la sensibilité, de Legionella, dans différents états physiologiques et étudié l’impact de la qualité de l’eau et des MES. Les cellules post-amibes et dans une moindre mesure, les cellules en phases stationnaires sont les moins sensibles. L’effet de la matrice a été mis en évidence pour l’eau de Vienne, par contre la sensibilité n’a pas été modifiée suite à l’élimination ou l’enrichissement en MES. Cette étude constitue une base de connaissances nouvelles pour orienter les choix de gestion du traitement anti-Legionella à la monochloramine et d’exploitation des circuits.

  • Occurrence des légionelles dans les eaux thermales tunisiennes et évaluation de l'activité anti-legionella des huiles essentielles de plantes autochtones    - Chaftar Nawel  -  06 novembre 2013

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    L'environnement des stations thermales est favorable à la croissance des Legionella. La Tunisie compte de nombreux sites thermaux. Elle a par ailleurs développé une médecine traditionnelle à base de plantes. L'objectif de ce travail était de caractériser des souches de légionelles isolées de stations thermales et d'étudier le potentiel antimicrobien d'HE de plantes tunisiennes. 2 souches de L. londiniensis et 16 de L. pneumophila (sérovars 1, 4, 5, 6 et 8) ont été isolées de 3 stations thermales tunisiennes et avaient des pulsotypes différents de ceux de la base du CNRL. Les HE de 6 plantes tunisiennes ont été extraites, analysées (GC-MS) et testées contre L. pneumophila (8 souches, sérovars 1, 4, 5, 6 et 8). Les HE de Juniperus phoenicea L. (isobornéol 20,91% et 1S α-pinène 18,30%) et Thymus vulgaris (carvacrol 88,50%) étaient les plus actives (CMI <0,03 mg/mL et ≤0,07 mg/mL respectivement). L'activité de 20 HE (6 de plantes tunisiennes et 14 commerciales) a été évaluée contre 11 espèces bactériennes (6 Gram+, 5 Gram-) et 7 fongiques (4 levures, 3 filamenteux). L'HE de T. vulgaris tunisien était la plus active (Gram-: CMI ≤0,34 mg/mL ; Gram+: CMI ≤0,7 mg/mL ; levures: CMI ≤0,55 mg/mL ; moisissures: CMI=0,3 mg/mL ; dermatophytes: CMI ≤0,07 mg/mL). Elle a montré une activité très supérieure à celle de l'HE commerciale de T. vulgaris certainement due à sa composition différente. En conclusion, la présence de Legionella dans les sites étudiés doit encourager les autorités à renforcer les mesures préventives et l'efficacité antimicrobienne des HE, en particulier l'HE de T. vulgaris tunisien, suggère leur possible intérêt dans le traitement des eaux ou la conservation des aliments.

  • Étude des déterminants génétiques et environnementaux des complications du diabète de type 2    - Saulnier Pierre-Jean  -  20 décembre 2012

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    Le diabète de type 2 (DT2) représente un enjeu de santé publique au regard de ses complications, qui sont des maladies complexes, où interagissent des déterminants génétiques et environnementaux. L'objectif de ce travail était d'étudier ces déterminants dans trois populations indépendantes de patients DT2 en couplant études transversales (DIAB2NEPHROGENE) et longitudinales (SURDIAGENE et DIABHYCAR) totalisant 7767 sujets. Via une approche gène-candidat, nous avons focalisé nos recherches sur le système des peptides natriurétiques, le gène NPR3 (codant le récepteur de clairance aux peptides natriurétiques) et les apports sodés puis la voie métabolique des hormones sexuelles, le gène CYP19A1 (codant l’aromatase) et les concentrations de stéroïdes sexuels. Nous avons montré que l'allèle G du rs2270915 du NPR3 est un allèle de risque de pression artérielle (PA) plus élevée et de moindre sensibilité pressive à la réduction sodée qui ne confère pas d'augmentation significative de risque d'évènements cardiovasculaires (ECV) contrairement au rs6889608. Enfin, la survie sans ECV est significativement modulée par les apports en sel avec un risque de morbi-mortalité réduit chez les sujets diabétiques consommant le plus de sel malgré un niveau de PA plus élevé. Nous avons confirmé que le sexe masculin est un facteur de risque pour la néphropathie diabétique (ND) mais également pour la survenue d'ECV. Nous avons montré, chez les hommes, que des concentrations plus élevés d'oestradiol s'associent à une prévalence plus importante de ND mais ne se traduisent pas par une augmentation des événements rénaux ou cardiovasculaires. CYP19A1 n'est associé ni avec les niveaux d'oestradiol, ni avec la prévalence ou la sévérité de la ND. Deux SNP s'associent toutefois significativement avec la survenue d'insuffisance rénale chronique terminale. Au total, nous avons identifié dans 2 voies métaboliques distinctes des déterminants génétiques de complications du DT2 ainsi qu'une interaction gène-environnement.

  • Caractérisation et étude du mode d'action de peptides anti-Legionella    - Marchand Adrienne  -  02 décembre 2011

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    L'objectif de mon travail a consisté à identifier puis étudier des peptides anti-Legionella produits par divers Staphylococcus. La première partie a consisté à cribler une collection de Staphylococcus pour sélectionner les souches actives contre Legionella, puis de purifier et d'identifier les peptides actifs. 12 peptides ont été caractérisés et leurs activités anti-Legionella et hémolytique déterminées. Ceci a permis de les classer en deux groupes. Le groupe 1, représenté par la WRK de S. warneri, correspond aux peptides bactéricides et très hémolytiques. Le groupe 2, représenté par la PSMα de S. epidermidis, correspond aux peptides bactériostatiques et peu hémolytiques. Une étude structure-activité de la WRK et la PSMα a ensuite été réalisée pour identifier les motifs structuraux responsables des activités anti-Legionella et hémolytique. 23 peptides, modifiés à partir des séquences de la WRK et de la PSMα, ont été synthétisés et testés. Ceci a mis en évidence certains résidus dont la modification permet de moduler ces activités. Ainsi, la substitution d'une glycine par une lysine en position 14 de la PSMα permet d'obtenir un peptide bactéricide, comme la WRK, mais peu hémolytique, comme la PSMα. D'autre part, il est apparu que la présence de phosphatidylcholine au sein des membranes rend celles-ci plus sensibles aux peptides testés. Enfin, la dernière partie de ce travail a consisté en une étude complémentaire du mode d'action de la WRK. Son action sur les membranes de Legionella a été analysée par microscopie électronique et par résonnance magnétique nucléaire du ³¹P et du ²H. Enfin, une activité anti-cancéreuse de la WRK a été mise en évidence.

  • Impact des facteurs environnementaux sur l'état physiologique et l'infectiosité de Legionella pneumophila Lens    - Koubar Mohamad  -  15 juin 2011

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    Nous avons étudié l'impact des différents facteurs environnementaux tel que la présence de matières minérales ou organiques sur le comportement de L. pneumophila dans le milieu hydrique. Nous n'avons pas observé d'influence importante de la présence des matières minérales ou organiques sur la survie des légionelles dans l'eau. Cependant, la présence de matières minérales, notamment le calcium, favorise l'adhérence de L. pneumophila aux surfaces. Nous observons que le maintien de la bactérie dans une solution de chlorure de calcium, par rapport à de l'eau distillée, provoque des modifications du profil protéique. Nous avons également étudié l'impact du passage de Legionella à travers Tetrahymena tropicalis, un cilié d'eau douce isolé dans les mêmes niches écologiques de Legionella. Le travail réalisé montre que les légionelles post-Tetrahymena deviennent plus résistantes à différentes conditions de stress (antibiotiques, carence nutritionelle) et plus infectieuses pour les pneumocytes humains par rapport à des légionelles cultivées en phase stationnaire. L'impact important que semble jouer ces protozoaires sur le risque légionelle devrait donc être pris en compte et la relation légionelles-Tétrahymena être étudiée de façon plus intensive. Nous avons également évalué l'infectiosité de différents phénotypes de L. pneumophila sur cellules humaines (macraphages, pneumocytes) et sur modèle murin (souris A/J, expérimentations réalisées dans l'Unité INSERM U151 sous la direction du Dr Florence Ader), en utilisant des bactéries ayant séjournées dans l'eau distillée ou dans l'eau minérale et des bactéries post-amibies, répliquées dans l'amibe Acanthamoeba castellanii...

  • Études moléculaire et cellulaire des mutations du gène CFTR : de la génétique à la fonctionnalité de la protéine    - El-Seedy Ayman-Salah-Ahmed  -  17 février 2011

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    La mucoviscidose est la maladie génétique grave à transmission autosomique récessive la plus fréquente dans les populations d'origine européenne. Cette pathologie est due au dysfonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), canal chlorure présent à la membrane apicale des cellules épithéliales. La gravité de la pathologie dépend de la ou des mutations du gène CFTR. L'objectif de nos travaux est de comprendre l'impact des mutations du gène CFTR afin d'établir un conseil génétique avisé. Pour cela, nous avons dans un premier temps déterminé quelles sont les mutations présentes sur l'exon 9 du gène. A cause de la présence de copies de cette région, nous avons établi de nouvelles conditions expérimentales pour étudier exclusivement le gène, et ainsi deux pseudomutations ont été détectées. Dans un second temps, nous avons étudié trois allèles complexes contenant des mutations fréquentes de CFTR (D443Y, G576A, R668C) et une mutation rare, G149R. In vitro nous avons mis en évidence l'effet délétère de G149R seule ou en complexe, et la diminution de la quantité de la protéine mature lorsque les autres allèles complexes sont présents. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons mis en place au laboratoire les techniques d'étude de l'épissage. Pour cela, nous avons construit un minigène hybride qui nous permet de définir le rôle exact des substitutions nucléotidiques sur l'épissage alternatif. Les résultats obtenus à partir de ces trois études nous ont permis de mieux comprendre l'impact des mutations étudiées et ainsi d'émettre un diagnostic moléculaire documenté.

  • Etude du mécanisme d'action de biocides oxydants sur Acanthamoeba castellanii    - Mogoa Emerancienne  -  15 novembre 2010

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    Les amibes sont des pathogènes opportunistes vivant dans des milieux naturels et artificiels. Elles jouent le rôle de réservoirs et de vecteurs de bactéries pathogènes comme Legionella. Elles présentent donc une réelle menace pour la santé publique. De plus, il y a peu d'informations sur le mode d'action des biocides utilisés dans la désinfection des amibes. Ainsi, l'objectif de ce travail a été de comparer la réponse cellulaire d'Acanthamoeba castellanii au chlore (Cl2), au dioxyde de chlore (Cl2) et à la monochloramine (NH.Cl). La mesure de cultivabilitépar la méthode du Nombre le Plus Probable montre que NH2Cl est de 15 à 30 fois moins efficace que Cl2 et ClO2 pour atteindre 99,9% d'inactivation. L'analyse de la perméabilité et de la morphologie cellulaire par cytométrie après marquage de l'IP et au Syto9 montre que Cl2 induit la perméabilisation et la diminution de la taille. Mais les changements avec le ClO2 et le NH2Cl varient selon les doses. La microscopie confocale et électronique a permis d'observer une désorganisation de l'actine et des changements cytoplasmiques. Enfin l'analyse des antioxydants a montré que les biocides affectent différemment le système de défense contre le stress oxydant. Les résultats montrent que ces biocides ont des effets très différents sur A. castellanii et que les cellules exhibent diverses réponses cellulaires et antioxydantes. Ce travail est une base pour une meilleure compréhension du mécanisme d'action de ces biocides et fournir des informations pour améliorer leur utilisation dans l'eau.

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