UPThèses

L'ischémie reperfusion se caractérise par deux phases distinctes : une cessation puis un retour de l’apport sanguin et peut se produire dans certaines situations pathologiques et lors de la transplantation d’organes. Cette séquence d’évènements peut induire la mort cellulaire, la formation de débris cellulaires et de microparticules. Les corps apoptotiques et les microparticules se caractérisent par l’exposition de la phosphatidylsérine sur le feuillet externe de leur membrane. Les cellules lésées suite à l’ischémie reperfusion entraînent, par le relargage de cytokines/chimiokines, l’activation de l’inflammation et le recrutement de leucocytes, tel que les macrophages. Les macrophages permettent l’élimination par phagocytose des débris cellulaires et des microparticules. Il a été établi précédemment que le récepteur tyrosine kinase MerTK, exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages, joue un rôle majeur dans la phagocytose. En effet, l’interaction du récepteur MerTK avec son ligand, la protéine S, permet la formation d’un pont entre le macrophage et les phosphatidylsérines exposées par les corps apoptotiques et les microparticules. MerTK contribue aussi à une régulation négative de l’expression de certaines molécules pro-inflammatoires impliquées dans le recrutement leucocytaire. L’objectif de notre étude est de caractériser le rôle de MerTK dans le développement des lésions induites par une ischémie reperfusion rénale mais aussi dans la réparation post-ischémique. Nous avons utilisé un modèle de rats RCS (Royal College of Surgeons) caractérisés par un MerTK défectueux en raison d’une mutation naturelle dans le gène MerTK. La simulation de l’ischémie reperfusion rénale s’effectue par le clampage de l’artère et de la veine rénale. Le sang et les reins prélevés permettent d’évaluer, via des techniques d’ELISA, de Western Blot et de dosages biochimiques, des marqueurs de la fonction et de lésions rénales, d’inflammation et de recrutement leucocytaire. Les lésions histologiques sur des coupes rénales sont mises en évidence par les colorations HES-PAS, et la localisation ainsi que la quantification du recrutement leucocytaire ont été évaluées par la technique d’immunohistochimie. Nous avons par ailleurs utilisé la technique de cytométrie en flux pour quantifier les microparticules d’origine plaquettaires, endothéliales et leucocytaires dans le plasma. Enfin, nous avons étudié le rôle possible de MerTK dans la phagocytose in vitro, par co-incubation de corps apoptotiques avec des monocytes/macrophages, provenant de sang de rats RCS déficients en MerTK ou de rats contrôles exprimant normalement ce récepteur.

Des cellules souches neurales (CSN) persistent dans le cerveau de mammifères adultes, y compris l'Homme. Les CSN participent à l'homéostasie tissulaire en générant de nouveaux neurones, permettant le remplacement de certains neurones morts. Cependant, la production de nouvelles cellules se fait en excès et plus de la moitié des cellules nouvellement générées meurent. Les cellules mortes ainsi que leurs débris doivent être éliminés par phagocytose. Dans une première partie de ma thèse, nous avons montré pour la première fois, que les CSN sont capables de phagocytose et que cette activité des CSN est régulée par la protéine S (ProS), une protéine vitamine-K dépendante, et son récepteur MerTK. Une rupture de l'homéostasie tissulaire conduit à des pathologies dont les cancers. Les interactions entre les CSN et des tumeurs cérébrales, les gliomes, sont duelles et étroites : des CSN dont la prolifération est dérégulée seraient à l'origine des tumeurs, mais, à l'inverse, les CSN saines peuvent migrer vers les gliomes et inhiber leur croissance. Dans une deuxième partie de ma thèse, nous avons confirmé l'effet anti-tumoral des CSN et nous avons établi que la ProS sécrétée par les gliomes attire les CSN vers la tumeur d'une part, et d'autre part, que les CSN diminuent la croissance tumorale par la sécrétion de leur ProS. Nous démontrons de plus, que ce processus s'accompagne d'une mort cellulaire des gliomes dont les débris sont phagocytés par les CSN. Mon travail de thèse a permis d'identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le maintien de l'homéostasie tissulaire par les CSN en conditions physiopathologiques.

L'angiogenèse est un processus physiologique qui correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau vasculaire préexistant et est régulée par l'équilibre entre les facteurs endogènes pro- et anti-angiogéniques. La rupture de cet équilibre est associée à de nombreuses pathologies dont l'ischémie, la rétinopathie ou encore la progression tumorale. Etant donné que les cellules endothéliales, principal type cellulaire composant les vaisseaux sanguins expriment les récepteurs à activité tyrosine kinase du facteur anticoagulant, la protéine S, Tyro3, Axl et Mer et produisent de la protéine S, l'objectif de ce travail est d'étudier le rôle, de la protéine S dans l'angiogenèse. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré in vivo que la protéine S inhibe l'angiogenèse induite par les facteurs pro-angiogéniques (VEGFA et FGF2). Parallèlement, nous avons observé in vitro une inhibition par la protéine S de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales induites par le VEGFA. Cet effet est corrélé à l'inhibition par la protéine S des voies de signalisation des MAP-Kinases et de la phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3) induites par le VEGFA. Nous avons ensuite mis en évidence, par l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et de petits ARNs interférents, que la protéine S inhibe, via l'activation du récepteur Mer et le recrutement de la protéine phosphatase SHP2, l'activation du VEGFR2, le principal récepteur du VEGFA. Dans la deuxième partie, nous avons montré de manière intéressante que le rôle joué par la protéine S lors de l'angiogenèse est plus complexe, puisqu'elle est capable d'activer directement la voie de signalisatio

Les protéines vitamine K-dépendantes (PVKDs) sont une famille de protéines connues pour leur implication dans la régulation de la coagulation sanguine. Leur activité dépend d'une modification post-traductionnelle, la γ-carboxylation qui est inhibée par la warfarine. Deux PVKDs, les protéines S et Gas6 ont été identifiées comme ligands des récepteurs tyrosine kinase de la famille TAM. L'étude menée chez les souris invalidées pour ces récepteurs suggère une implication des PVKDs dans la neurogenèse. Chez les rongeurs, la neurogenèse assurée par les cellules souches neurales (CSN) persiste à l'âge adulte dans quelques régions cérébrales dont la zone sous-ventriculaire (SVZ). Mon travail de thèse a eu pour objectif majeur de comprendre l'effet des PVKDs sur l'activité des CSN de la SVZ mais aussi l'implication de la protéine Gas6 dans la rétinogenèse. Nos résultats montrent que l'inhibition de la sécrétion des PVKDs par la warfarine stimule la prolifération des CSN. En outre, nous montrons que les récepteurs TAM et leurs ligands sont exprimés par les CSN et dans le LCR, que la protéine S exogène inverse les effets de la warfarine et que l'absence de la protéine Gas6 chez les souris Gas6-/- induit une réduction de la prolifération des CSN. L'ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence l'implication des PVKDs dans la régulation de la prolifération des CSN. La deuxième partie de ce travail montre que les CSN possèdent une activité phagocytaire basale qui est stimulée par la protéine S. La troisième partie de ce travail montre que chez les souris Gas6-/- soumises à une lésion rétinienne, la prolifération cellulaire permettant la réparation de la lésion...