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64 - Biochimie et biologie moléculaire

Les thèses se rapportant à la section CNU "64 - Biochimie et biologie moléculaire"

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  • Mise en place de modèle de microbiotes intestinal et cutané in vitro pour l'étude de leur interaction avec les xénobiotiques    - Écale Florine  -  12 février 2021

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    Les microbiotes intestinal et cutané humains sont deux écosystèmes stables et propres à chaque individu. Néanmoins, il existe dans chacun d’eux, un socle de souches communes, le core microbiote. De nombreux facteurs exogènes, comme les xénobiotiques, peuvent perturber et influencer la composition des microbiotes et provoquer une dysbiose, pouvant participer à plusieurs pathologies. En outre, ces microorganismes peuvent métaboliser, voire dégrader ces composés les rendant ainsi inactifs. Il est donc important de pouvoir mettre en évidence les effets potentiels des xénobiotiques sur les bactéries mais également d’identifier les souches responsables de la métabolisation des composés. Les buts de la thèse ont été la mise en place de modèle de microbiote intestinal et cutané, tout d’abord en individualisant les souches, puis en les regroupant en consortium afin de déterminer i- les effets de différents xénobiotiques sur les microbiotes et ii- l’impact de ces microbiotes sur les molécules testées. Un modèle représentatif du core microbiote intestinal composé de 30 souches ainsi qu’un modèle d’étude des souches individuelles a été en réalisé en microplaque dans un milieu unique. Les résultats ont montré que la croissance des 36 souches en culture unique ainsi que le consortium stabilisé de 30 souches est inhibée majoritairement en présence d’antibiotiques. L’analyse des surnageants de culture (souches uniques ou consortium) par UHPLC-MS/MS a, quant à elle, révélé que des xénobiotiques peuvent être modifiés chimiquement par les bactéries. Concernant le modèle cutané, nous avons mis en évidence que les parabènes n’ont pas d’action sur les staphylocoques du microbiote cutané mais que des modifications de structure de ces perturbateurs endocriniens sont retrouvés en présence de nombreuses souches bactériennes. Sur la base de nos résultats, ce modèle simplifié pourrait permettre à terme de faciliter l’étude de l’impact des xénobiotiques sur certains microbiotes, facilitant certaines étapes du développement de nouvelles thérapies.

  • Extraction et caractérisation de nouveaux antibactériens produits par les actinobactéries prédatrices d'origine marine    - Ibrahimi Manar  -  07 mars 2020

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    Ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre de la recherche de nouveaux moyens de lutte contre les bactéries multirésistantes. L’approche suivie est le criblage d’actinobactéries d’origine marine, prédatrices facultatives des bactéries multirésistantes. Les actinobactéries prédatrices ont été isolées à partir des eaux marines de la côte atlantique marocaine. Parmi les 142 prédateurs potentiels, 4 actinobactéries se sont avérées capables de croître en présence de Micrococcus luteus comme seule source de nutriments. En co-culture sur milieu solide, les quatre isolats ont montré une aptitude à croître sur différents types de bactéries (Gram +, Gram-) y compris les bactéries multirésistantes. En monoculture, l’activité antibactérienne sur un milieu riche (Bennett) a été testée via la méthode des disques d’agar. Les isolats d’actinobactéries sélectionnés montrent des spectres d’activité variables. L’étude taxonomique des 4 isolats sélectionnés par l’approche polyphasique a permis de les identifier comme étant des espèces appartenant au genre Streptomyces. La souche S. griseoflavus EMM111 a été retenue pour évaluer sa capacité à détruire par prédation le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline. Les acides gras membranaires libérés sous forme d’esters méthyliques par thermochimiolyse couplée à la GC-MS ont permis de caractériser le prédateur et la proie. La co-culture du prédateur et de la proie, suivie pendant 15 jours, induit une augmentation de la quantité totale d’acides gras méthylés biomarqueurs de S. griseoflavus EMM111 mettant ainsi en évidence la prédation. La dernière partie de ce travail a été consacrée à l’extraction des molécules impliquées dans la prédation par la souche S. griseoflavus EMM111. Après fractionnement, plusieurs molécules ont été identifiées parmi lesquelles le di(2-ethylhexyl) phthalate, un composé présentant une activité bactéricide.

  • Mise en évidence de gènes d'amibes libres impliqués dans l'interaction avec des bactéries intracellulaires    - Rolland Steven  -  15 octobre 2019

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    Les amibes libres sont des protistes qui colonisent des systèmes aqueux naturels ou artificiels. Certaines souches parmi le genre Acanthamoeba sont responsables de pathologie infectieuse chez l’Homme. Par ailleurs, en réponse à des stress environnementaux, les amibes se différencient en une forme de résistance appelée kyste, les protégeant ainsi contre les conditions de vie défavorable. Les amibes libres sont décrites comme des réservoirs environnementaux pour de nombreux pathogène de l’Homme, telle que la bactérie Legionella pneumophila, agent responsable d’une forme grave de pneumonie : la légionellose. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux gènes d’amibes libres pouvant être impliqués dans la biologie de l’amibe, notamment l’enkystement, et lors de l’interaction avec L. pneumophila. Pour cela, plusieurs protéines d’A. castellanii ont été sélectionnées à partir d’une analyse protéomique d’amibes infectées par cette bactérie. La surexpression de ces gènes dans l’amibe n’affecte pas la croissance intracellulaire de L. pneumophila. Cependant, la surexpression de deux de ces gènes inhibe partiellement le processus d’enkystement. L’une d’entre elles, la protéine Erat, a été analysée plus en détails. C’est une N-acétyltransferase-like de la famille des GNATs, d’origine possiblement procaryotique, et dont l’expression est fortement réprimée durant l’enkystement. L’ensemble de ces travaux a permis de développer des outils moléculaires sur le modèle A. castellanii, ainsi que d’améliorer la connaissance sur la physiologie de l’amibe et notamment sur le processus d’enkystement.

  • Biopréservation de matrices lactées par des ferments bactériens    - Rouxel Meg  -  04 octobre 2019

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    Tout au long du processus de transformation et de stockage, les matières premières alimentaires sont susceptibles d’être colonisées par des micro-organismes. On estime que 5 à 10 % de la production alimentaire mondiale est perdue du fait de la prolifération de levures et/ou moisissures au sein de ces matrices. L’industrie laitière est la deuxième filière agro-alimentaire au monde et celle-ci n’est pas épargnée par ces contaminations. Pour résoudre cette problématique et répondre à la demande grandissante des consommateurs visant à éliminer les conservateurs chimiques dans les produits alimentaires, la biopréservation par des ferments bactériens représente la meilleure alternative. Dans cette étude, la capacité antifongique de 18 souches de lactobacilles a été analysée vis-à-vis de la croissance de souches fongiques isolées de produits laitiers contaminés. Quatre souches de Lactobacillus présentant le spectre d’inhibition le plus large ont ainsi été sélectionnées. La caractérisation des molécules antifongiques produites a été réalisée à partir de cultures en milieu MRS, milieu lait et fromages frais, révélant la synergie de l’acide lactique avec d’autres molécules. Ces molécules se sont révélées faiblement produites et correspondent à des acides organiques issus de la dégradation d’acides aminés (acide phényllactique, acide benzoïque, …), des acides gras (C12, C14, C16 saturé ou non, C18 saturé ou non) et des molécules volatiles ou semi-volatiles (diacétyle, acide acétique, …). L’augmentation de l’activité antifongique par surproduction de ces molécules a par la suite été tentée par différentes approches : mutagénèse aléatoire, ajout de précurseurs dans le milieu, etc, malheureusement sans succès.

  • Identification et caractérisation de composés produits par des bactéries environnementales pour la lutte biologique contre Legionella pneumophila    - Corre Marie-Hélène  -  10 décembre 2018

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    Les circuits et réseaux d’eau subissent épisodiquement des problèmes de contamination par des microorganismes tels que Legionella pneumophila, conduisant à la dégradation de la qualité microbiologique de l’eau circulante. De nouveaux moyens de traitements doivent être mis en place de façon notamment à limiter l’usage de biocides chimiques. Ce travail de thèse s’inscrit dans cette problématique et a pour objectif d’identifier de nouveaux composés actifs contre L. pneumophila en tenant compte de son comportement et de ses interactions au sein de son microenvironnement. De manière à obtenir des composés produits par des souches bactériennes appartenant à la même niche écologique que L. pneumophila, une campagne de prélèvement d’eau a été réalisée. Un total de 273 isolats environnementaux ont été isolés et testés contre L. pneumophila. Les résultats obtenus indiquent que 178 de ces isolats (65%) présentent une activité anti-Legionella. Quatre souches ont ensuite été sélectionnées (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52 et Pseudomonas spp PW329) et les composés actifs produits ont été caractérisés. A. bestiarum SW257 produit un peptide anti-Legionella. Flavobacterium sp. PW52 produit un mélange de composés anti-Legionella ayant des propriétés tensioactives, les flavolipides. Pseudomonas sp. PW329 produit des composés organiques volatiles, identifiés par SPME-GC-MS, actifs contre L. pneumophila. Enfin, R. aquatilis SW265 produit un sidérophore à activité anti-Legionella.

  • Étude de la prolifération d'Acanthamoeba castellanii suite à l'infection par Legionella pneumophila    - Mengue Assoumou Louma Luce Laétitia  -  05 avril 2017

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    Acanthamoeba castellanii est une amibe libre ubiquiste de l'environnement. Elle se nourrit principalement de micro-organismes par phagocytose. Seulement, certains micro-organismes ont développé des mécanismes de résistances qui leur permettent d'échapper à la digestion et même de se multiplier à l'intérieur des amibes. C'est le cas de Legionella pneumophila, bactérie responsable de la légionellose. Legionella pneumophila, à travers son système de sécrétion Dot/Icm, injecte plusieurs effecteurs à l'intérieur de son hôte. Ces effecteurs interagissent avec les protéines de l'hôte, et induisent une modification de la physiologie de son hôte, à son avantage. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux effets de Legionella pneumophila, sur la prolifération de son hôte amibien. Nous avons montré que Legionella pneumophila arrête la prolifération d'Acanthamoeba castellanii. Ce phénotype était associé une modification de la forme, à une perte d'adhérence et à une baisse de motilité de l'amibe. Sur le plan moléculaire, Legionella pneumophila induit une baisse dans l'expression du gène cdc2b, qui présente des similarités avec le gène cdk1 (cyclin dépendant kinase), codant pour la CDK essentielle au déroulement du cycle cellulaire chez les mammifères. L'arrêt de la prolifération d'Acanthamoeba castellanii, qui passe par une réduction d'expression de cdc2b, est certainement induit par un ou plusieurs effecteur(s) de Legionella pneumophila, car le mutant ΔdotA de L. pneumophila, défectueux au niveau de l'appareil de sécrétion Dot/Icm, n'induit pas l'arrêt de la prolifération d'Acanthamoeba castellanii.

  • Interactions amibes libres / micro-organismes : préférence trophique et étude comparative avec les macrophages    - Maisonneuve Elodie  -  23 mars 2017

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    Les amibes libres sont des protozoaires retrouvés dans de nombreux environnements où ils ingèrent par phagocytose des bactéries, des champignons, des virus ou d'autres protozoaires. Le modèle d'étude principal de cette thèse, divisée en deux grandes parties, a été Acanthamoeba castellanii. La première partie de la thèse a concerné l'étude de la préférence trophique des amibes, en présence de différents micro-organismes. Parmi ceux-ci, deux bactéries, Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus, se sont montrées les plus attractives pour les protozoaires étudiés. Des extraits bactériens ont été fractionnés et leur étude a permis de mettre en évidence la nature protéique des composés chimioattractifs impliqués dans ce dialogue intergenre. Certaines données de la littérature ont rapporté les similitudes entre A. castellanii et d'autres cellules phagocytaires que sont les macrophages. La seconde partie de la thèse a permis de comparer les activités de phagocytose d'A. castellanii et de la lignée macrophagique Thp-1 vis-à-vis de quatre micro-organismes : le champignon filamenteux Aspergillus fumigatus, les bactéries Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus, et un Adénovirus sérotype B3. L'influence des deux types de cellules phagocytaires sur la croissance des micro-organismes a également été étudiée. Ces travaux ont permis de mettre en évidence des différences de comportements des amibes libres par rapport aux macrophages vis-à-vis de micro-organismes pathogènes, montrant qu'il n'est pas toujours possible d'extrapoler les résultats d'études amibes libres/micro-organismes aux relations macrophages/micro-organismes.

  • Rôle de l'oncostatine M et des interleukines 6 et 31 dans l'inflammation cutanée chez la souris    - Pohin Mathilde  -  17 janvier 2017

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    Le psoriasis et la dermatite atopique sont des pathologies inflammatoires cutanées chroniques, fréquentes et invalidantes. Dans la peau des patients souffrant de ces pathologies, un dérèglement de la réponse immunitaire aboutissant à une inflammation chronique est toujours observé. Le réseau cytokinique joue un rôle essentiel dans la physiopathologie cutanée en permettant la communication entre les cellules cutanées et les cellules immunitaires. Dans le psoriasis et la dermatite atopique, ce réseau est largement perturbé. En effet, un grand nombre de cytokines proinflammatoires sont surexprimées au détriment des cytokines anti-inflammatoires. Cette inflammation chronique est directement responsable de l'apparition des lésions cutanées. Parmi les cytokines surexprimées dans ces pathologies, des études antérieures du LITEC ont montré in vitro que l'Oncostatine M (OSM) est impliquée dans la production de peptides antimicrobiens et de médiateurs de l'inflammation, ainsi que dans l'inhibition de la différenciation des kératinocytes. Notre objectif était de poursuivre ces travaux en étudiant le rôle de l'OSM dans l'inflammation cutanée in vitro et in vivo chez la souris. Nous avons pour cela, comparé le rôle de l'OSM à celui d'autres cytokines de la famille de l'IL-6, l'IL-6 et l'IL-31, qui présentent également une activité sur le kératinocyte. L'activité de ces cytokines a été étudiée in vitro sur des cultures primaires de kératinocytes murins en monocouche, sur des épidermes reconstruits murins ainsi qu'in vivo dans différents modèles d'inflammation cutanée. Nous montrons que l'OSM est plus active que l'IL-6 et l'IL-31 sur les kératinocytes en culture et que la surexpression de cette cytokine in vivo dans la peau de souris à l'aide d'adénovirus recombinants induit une inflammation cutanée forte, présentant des caractéristiques communes avec le psoriasis et la dermatite atopique. Néanmoins, les souris déficientes pour le gène codant l'OSM ne présente aucune diminution du phénotype inflammatoire cutané dans le modèle de psoriasis induit par application d'Imiquimod et dans un modèle de dermatite atopique induit par application de Calcipotriol, suggérant l'existence de mécanismes de compensation par d'autres cytokines proinflammatoires. En parallèle de cette étude, nous avons mis au point un nouveau modèle d'épidermes reconstruits murins permettant l'étude de l'activité des cytokines sur les kératinocytes. Ce modèle présente l'avantage de reproduire plus finement la physiologie d'un épiderme normal par rapport aux autres modèles préalablement décrits et ouvre la perspective de développer des épidermes reconstruits à partir de kératinocytes de souris transgéniques. En conclusion, ces travaux démontrent le rôle pro-inflammatoire de l’OSM dans l'inflammation cutanée et son activité majeure sur les kératinocytes en comparaison à celles décrites pour l'IL-6 et l'IL-31. Néanmoins, la pertinence du ciblage thérapeutique de cette cytokine dans le psoriasis et la dermatite atopique reste encore à démontrer.

  • Évaluation et optimisation de l'efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs de l'acide folique    - Péraudeau Élodie  -  07 décembre 2016

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    En dépit des progrès réalisés ces dernières décennies, le cancer demeure un problème majeur de santé publique. La plupart des chimiothérapies conventionnelles exploitent les propriétés cytotoxiques d'agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu'elles soient cancéreuses ou non, ce qui peut aboutir à une toxicité importante et de sévères effets secondaires. Pour pallier à ce problème, l'utilisation de ligands de ciblage pour délivrer spécifiquement l'agent cytotoxique aux cellules malignes tout en épargnant les tissus sains est une approche prometteuse. Parmi les différents ligands exploités, l'acide folique fait l'objet d'une attention particulière due à la surexpression préférentielle de son récepteur par de nombreux types de cellules cancéreuses. Cependant, les essais cliniques menés sur des molécules reposant sur cette stratégie indiquent que leur efficacité dépend surtout du niveau d'expression du récepteur ciblé. Dans ce contexte, j'ai développé deux approches permettant d'augmenter l'efficacité du ciblage des récepteurs à l'acide folique. D'une part, j'ai réalisé la validation biologique de nouveaux conjugués conçus pour délivrer conjointement deux agents anticancéreux. D'autre part, j'ai mis au point un traitement capable d'augmenter, in vitro et in vivo, l'expression des récepteurs à l'acide folique à la surface des cellules tumorales. Cela aboutit à l'internalisation d'une plus grande quantité de vecteur, qui se traduit in vivo, par une inhibition plus importante de la croissance tumorale, sans toxicité sur les cellules saines.

  • Diversité et implication des amibes libres dans la survie et la persistance des mycobactéries non tuberculeuses au sein d'un réseau d'eau potable    - Delafont Vincent  -  21 octobre 2015

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    Les amibes libres sont des microorganismes unicellulaires eucaryotes dont l'écologie au sein des réseaux d'eau potable est mal connue. Les amibes libres représentent un enjeu de santé publique, du fait de leur capacité à favoriser la présence de bactéries potentiellement pathogènes, parmi lesquelles des mycobactéries. Une campagne de prélèvement menée sur le réseau d'eau potable de Paris a permis d'évaluer la diversité des amibes libres et de leur microbiome bactérien, par pyroséquençage ciblant les gènes ribosomaux (16S et 18S). Ces analyses ont suggéré la prédominance des genres Acanthamoeba, Vermamoeba, Echinamoeba et Protacanthamoeba. Le microbiome des amibes a révélé une grande diversité bactérienne, dominée par Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bradyrhizobium, Sphingomonas et Pseudoxanthomonas. L'intégration des paramètres physicochimiques a permis de suggérer l'importance de l'origine de l'eau, la température, le pH et la concentration en chlore dans la dynamique des populations amibiennes. Une endosymbiose originale entre V. vermiformis et des bactéries du phylum TM6 a également été mise en évidence. Les amibes ont été fréquemment co-isolées avec des mycobactéries dans le réseau, principalement les espèces M. llatzerense et M. chelonae. Des expériences d'infection chez A. castellanii ont permis d'observer la capacité de ces mycobactéries à survivre et croitre en présence d'amibes. Par génomique comparative et analyses transcriptomiques, plusieurs facteurs de virulence, conservés entre M. llatzerense, M. chelonae et M. tuberculosis, ont été identifiés et sont surexprimés au cours de l'infection. Ces données suggérent leur implication dans la résistance à la prédation amibienne. L'ensemble de ces travaux a permis d'améliorer la connaissance des populations amibiennes et de leur microbiome au sein du réseau d'eau potable, apportant des éléments supplémentaires concernant leur implication dans la survie et la persistance des mycobactéries.

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