UPThèses

L'angiodermite nécrotique ou "Hypertensive Leg Ulcer" (HLU) est un ulcère de jambe inflammatoire de traitement difficile, associé à une hypertension artérielle chronique. La douleur est très importante et nécessite l'utilisation de la morphine pour soulager les patients. Notre objectif était d'analyser les caractéristiques de l'inflammation et d'étudier son implication dans la physiopathologie de la nécrose cutanée. La peau inflammatoire est le siège d'un infiltrat composé de macrophages et de lymphocytes. L'épiderme et les cellules vasculaires lisses des microvaisseaux présentent des troubles de la différenciation et une importante prolifération. Nous observé une forte augmentation des transcrits de l'interleukine 1β (IL-1β), de l'IL-6 et de l'Oncostatin M (OSM), qui sont exprimées par les macrophages. Les kératinocytes humains in vitro et in vivo chez la souris montrent un phénotype semblable lorsqu'ils sont exposés à ces cytokines. Comparée à la peau inflammatoire et à la peau saine, la peau en périphérie de l'inflammation est douloureuse et présente des altérations histologiques intermédiaires. On observe une légère augmentation de l'expression des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM. D'autre part, la consommation de morphine est associée au niveau d'expression de l'OSM et l'inflammation systémique reflète la douleur ressentie par le patient. Ces éléments sont en faveur d'une implication des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM dans la physiopathologie de la douleur et de la nécrose dans l'HLU. Le cercle vicieux pourrait être bloqué par l'utilisation des biothérapies anticytokines, ce qui met en avant de nouvelles cibles thérapeutiques.

In vivo, l'épiderme se régénère en continu à travers la prolifération des cellules souches basales. Celles-ci obtenues à partir d'une biopsie cutanée, peuvent être greffées pour régénérer la peau. En vue de la transplantation kératinocytaire, nous avons étudié in vitro leur capacité à régénérer un épithélium en fonction de leur origine anatomique, et précisé leur phénotype. Par rapport aux différents sites étudiés, nous montrons que les kératinocytes issus de prépuce ont la plus grande capacité proliférative et régénérative, associée à une expression exacerbée de marqueurs d'immaturité, la p63 et la kératine 19 et une faible expression des marqueurs de la différenciation (involucrine et filagrine). Ces résultats nous ont amené à utiliser ces kératinocytes préputiaux en suspension pour transplanter les enfants brûlés, ce qui évite l'utilisation d'une membrane de transfert, source potentielle d'inefficacité. La transplantation des brûlures avec ces cellules autologues conduit à une épithélialisation accélérée avec une cicatrice de grande qualité. Ces résultats et la facilité de la procédure nous permettent de proposer la greffe autologue kératinocytaire de prépuce comme une procédure standard, qui peut être ajoutée à l'arsenal thérapeutique des équipes prenant en charge les enfants brûlés.

Le psoriasis apparait aujourd’hui comme une pathologie systémique en lien avec le syndrome métabolique et son expression hépatique, la stéatopathie hépatique métabolique (SHM), soulevant la question d’un dialogue entre le foie et la peau au cours du psoriasis ; les phénomènes inflammatoires systémiques chez les patients psoriasiques pourraient induire une hépatite chronique d’évolution fibrosante, et inversement, la prévalence augmentée de la SHM au cours du psoriasis pourrait aggraver la sévérité de l’atteinte cutanée. Nous avons étudié l’impact d’une SHM pré-existante sur la dermatite psoriasiforme murine induite par l’application topique d’imiquimod (IMQ), un agoniste des récepteurs de type Toll 7 et 8. La présence d’une SHM est associée à une aggravation de la dermatite et nous montrons une production cutanée d’interleukine-17A permettant d’expliquer l’exacerbation de la dermatite secondairement induite. Dans le second travail, en parallèle d’une évaluation de la fibrose hépatique dans une cohorte de patients psoriasiques, nous avons étendu le traitement topique par IMQ à 9 semaines afin de reproduire la chronicité du psoriasis. Alors que la sévérité du psoriasis est associée à une augmentation de la fibrose hépatique chez certains patients, la dermatite chronique expérimentale évolue vers une hépatite péri-portale avec une activation des cellules stellaires hépatiques, à l’origine d’une fibrose hépatique débutante. En conclusion, nous démontrons l’interrelation entre le psoriasis et le système immun hépatique, ceci devant inciter les praticiens à intégrer le dépistage de la SHM et de la fibrose hépatique dans la prise en charge du psoriasis.

Afin de mieux comprendre le mécanisme physiopathologique et inflammatoire impliqué dans la fièvre Méditerranéenne familiale (FMF), nous avons étudié le profil cytokinique ex vivo monocytaire et lymphocytaire des patients FMF. Nous avons ensuite étudié l’implication potentielle dans la FMF de la protéine RAC1, qui semble jouer un rôle dans la production de l’IL-1β, d’une part, et dans la production du stress oxydant, d’autre part. Enfin, nous avons recherché une association potentielle entre les gènes IL-1β et IL-1RA et la susceptibilité et/ou la sévérité de la maladie. La première partie de l’étude a porté sur 34 patients FMF génétiquement confirmés, dont 9 ont été prélevés à deux reprises, en crise et hors crise, et 24 sujets sains. Les marqueurs inflammatoires MBL et CRP ont été dosés dans le sérum par ELISA, et les cytokines ont été quantifiées par Luminex dans le sérum et les surnageants de culture de PBMC de patients et des contrôles avec ou sans stimulation des monocytes par LPS et des lymphocytes par anti-CD3/CD28. Dans la deuxième partie de ce travail, une étude comparative des niveaux d’expression du gène RAC1 chez les patients FMF, en crise ou non, et les contrôles a été effectuée par PCR quantitative en temps réel. L’IL-1β et l’IL-6 ont été dosées par ELISA en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1 dans les surnageants de culture de PBMC, avec ou sans stimulation par LPS. La quantification des marqueurs du stress oxydant a été effectuée dans le plasma ainsi que dans les surnageants de culture de PMN stimulés ou non par LPS, en présence ou en absence de l’inhibiteur de RAC1. Les génotypes au niveau des 3 polymorphismes à la position -511, -31 et +3954 d

Un réseau de cytokine complexe a été décrit dans le psoriasis mettant en évidence le rôle central des cytokines proinflammatoires dans la physiopathologie de cette maladie. Notre tentative de modéliser l'inflammation cutanée a montré que la combinaison de l'IL-17A, IL-22, IL-1α, oncostatine M (OSM) et le TNFα, augmente de manière synergique l'expression de chimiokines et de peptides antimicrobiens, reflétant certaines caractéristiques du psoriasis. D'autres caractéristiques de cette maladie sont l'acanthose et le blocage de la différenciation des kératinocytes. Notre premier objectif était d'étudier le rôle respectif de ces cytokines sur la différenciation des kératinocytes en comparaison avec les lésions de patients psoriasiques. Toutes ces cytokines inhibent l'expression des marqueurs de différentiation des kératinocytes, parmi lesquelles l’IL-22 et l’OSM sont les plus puissantes et le mélange M5 présente des effets synergiques. Si l'IL-22 et l'OSM déclenchent plus spécifiquement l'hyperplasie épidermique et le blocage de la différenciation, l’IL-1α, IL-17A et le TNFα sont plutôt impliqués dans l'activation de l'immunité innée. Le rôle fonctionnel de chacune de ces cytokines in vivo a été étudié dans un modèle d'inflammation cutanée de type psoriasique induit par l'imiquimod (IMQ), un agoniste TLR7, en utilisant des souris déficientes en cytokines. L'absence de l'OSM ou de l'OSMRβ n'a pas modifié le développement des lésions inflammatoires induites par l’IMQ. Une hypothèse est que d'autres cytokines peuvent avoir des effets redondants avec l'OSM. L'absence de l'IL-22 chez la souris diminue partiellement les lésions cutanées induites par l'IMQ, démontrant que son retrait du réseau cytokinique rompt une partie des effets synergiques des cytokines in vivo comme présenté dans le modèle M5. L'absence de l'IL-1α ou de l'IL-1β ne modifie pas l'inflammation cutanée induite par l'IMQ, ce qui n'est pas surprenant au vu des activités redondantes de ces deux cytokines. La diminution partielle de l'inflammation en absence d'IL-1α ET d'IL-1β OU de la chaine réceptrice commune IL-1RI confirme ces observations. A long terme ces études devraient permettre de proposer des stratégies anti-cytokine ciblées et combinées pour tenter de rompre la synergie et diminuer ainsi toutes les composantes de la réponse inflammatoire cutanée.

L’interleukine 34 (IL-34) est une cytokine exprimée par de nombreux tissus, néanmoins la peau constitue le site majoritaire de production d’IL-34, par les kératinocytes, où elle joue un rôle essentiel dans le développement et le maintien des cellules de Langerhans dans l’épiderme. Son expression et son rôle au cours de l’inflammation cutanée sont très peu décrits, bien que l’IL-34 ait été rapportée d’une part pour ses effets proinflammatoires dans certaines pathologies, d’autre part pour ses activités immunorégulatrices dans d’autres contextes physiopathologiques. Dans une première partie, nous nous sommes donc intéressés à l’étude de son expression cutanée en conditions saine et inflammatoire au cours du psoriasis et de son potentiel rôle tolérogène au niveau de la peau. Contrairement à la majorité des cytokines qui sont surexprimées en conditions inflammatoires, nous montrons que l’expression de l’IL-34 est réprimée dans les lésions de psoriasis par rapport à la peau saine, corrélée à une perte des cellules de Langerhans dans l’épiderme. A l’aide de modèles 2D et 3D de cultures de cellules épidermiques, nous démontrons in vitro que les niveaux d’expression de l’IL-34 sont étroitement liés à l’état de différenciation des kératinocytes et que les cytokines proinflammatoires, notamment celles qui altèrent la différenciation épidermique comme l’oncostatine M, sont responsables de la régulation négative de l’expression de l’IL-34. Enfin, le rôle régulateur de l’IL-34 a été mis en évidence par sa capacité à inhiber l’effet de l’oncostatine M sur le blocage de la différenciation épidermique. Dans une seconde partie, nous avons recherché un potentiel effet immunorégulateur de l’IL-34 sur d’autres cibles cutanées comme les cellules immunes résidentes ou infiltrant la peau. L’IL-34 ne semble pas influencer la différenciation in vitro des monocytes en cellules de Langerhans, ni leur capacité de cellules présentatrices d’antigènes, comme le montrent les résultats très variables obtenus lors de leur mise en cocultures avec des lymphocytes T naïfs. D’autres cocultures associant des cellules T régulatrices, cibles rapportées de l’IL-34, et des cellules T effectrices, ne montrent pas non-plus d’effet immunorégulateur de l’IL-34. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent que l’IL-34 n’a pas d’effet tolérogène sur les cellules immunes cutanées. Finalement, nous avons mis en évidence dans une troisième partie, une nouvelle source cutanée d’IL-34, le mélanocyte, qui présente une régulation opposée à celle des kératinocytes en condition inflammatoire. En effet, dans un modèle in vitro de mélanocytes inflammatoires mimant le vitiligo, nos résultats montrent une surexpression de l’IL-34 et des gènes caractéristiques de l’inflammation, une inhibition de l’expression des récepteurs de l’IL-34 ainsi que des gènes impliqués dans le fonctionnement des mélanocytes et la synthèse de mélanine. Des tests in vitro de stimulation de mélanocytes par l’IL-34 confirment que la cytokine ne semble pas moduler l’expression des gènes impliqués dans la physiologie des mélanocytes et n’entraîne pas d’augmentation de leur état inflammatoire. A l’inverse, nous montrons également une diminution globale de l’expression de l’IL-34 in vivo dans les zones péri-lésionnelles de peau de patients atteints de vitiligo. Ces résultats suggèrent que l’IL-34 relarguée par les mélanocytes, minoritaires par rapport aux kératinocytes dans l’épiderme, ne semble pas compenser leur diminution d’expression en condition inflammatoire, ni conférer de rôle protecteur particulier aux mélanocytes. En conclusion, l’ensemble de ces travaux permettent d’apporter de nouvelles connaissances sur l’expression, la régulation et les effets de l’IL-34 dans la peau humaine en conditions saine et inflammatoires.

Les tumeurs sébacées (TSs) sont des tumeurs cutanées rares, à la fois bénignes (adénomes sébacés ou ASs et sébacéomes ou Ss) et malignes (carcinomes sébacés ou CSs). Une proportion importante survient dans le cadre d’un syndrome de Muir-Torre-Syndrome de Lynch (SMT-SL). Ce syndrome peut être dépisté par immunohistochimie (IHC) et par biologie moléculaire (BM) qui permettront la détermination d’un phénotype « mismatch repair déficient » (dMMR) et par un score clinique de risque de la Mayo-Clinic, pour déterminer quels patients doivent avoir un génotypage. La présence d’un phénotype dMMR ne signifie pas que la tumeur est d’origine germinale, de nombreuses TSs étant sporadiques. Le phénotype dMMR est fréquent (70,7%), et une excellente concordance entre IHC et BM (coefficient Kappa de Cohen à 0,85) suggère que les 2 techniques sont équivalentes pour le dépistage du phénotype dMMR, avec 7,1% de discordances. Dans 20,3% de cas, la BM donne des résultats « sous réserve » ou pas de résultats, alors que l’IHC est toujours contributive, suggérant que l’IHC est supérieure à la BM. Parmi les 13 patients atteints de SMT-SL, 2 ont un faible score de risque de la Mayo-Clinic (1 point) et n’auraient pas été dépistés par ce score. Ainsi, l’IHC a la sensibilité la plus élevée pour le dépistage du SMT-SL (100%) avec une faible spécificité, tandis qu’un score de risque de la Mayo-Clinic >2 points a une sensibilité plus faible (92%) mais une spécificité plus élevée (89%). Par ailleurs, peu d‘études sont consacrées à l’analyse du microenvironnement immun des TSs, sinon sur l’expression de marqueurs de régulation de la réponse immune (PD-1, PD-L1) et jamais au lien entre la composition de ce microenvironnement et le statut MMR. Nous avons analysé la composition de ces infiltrats en comparant les zones (massifs tumoraux, stroma intra-tumoral et tissu conjonctif péri-tumoral) avec le type histologique, reflet de l’agressivité des TSs, puis selon le statut MMR (type de protéine(s) absente(s), existence ou non d’un SMT). Nous montrons que les infiltrats immuns (Lymphocytes T CD3, Lymphocytes T cytotoxiques CD8, Lymphocytes T helpers CD4, Lymphocytes Treg FOXP3, Lymphocytes B CD20, Macrophages CD68, Macrophages de type M1 INOS, Macrophages de type M2 CD163, Cellules dendritiques CD11c), comme l’expression des molécules PD-1 et PD-L1, sont plus importants dans le stroma intra-tumoral que dans les massifs tumoraux et le tissu conjonctif péri-tumoral. Les CSs ont un infiltrat immunitaire plus dense en macrophages M2 et en DCs que les tumeurs bénignes, notamment les ASs. Dans le microenvironnement des CSs, l’expression de PD-L1 est plus importante que dans le microenvironnement des tumeurs bénignes, sans expression significative par les cellules tumorales. De plus, aucune différence dans la composition du microenvironnement des TSs a été observée selon le statut MMR, l’existence d’un SMT-SL, ou le type de protéine(s) absente(s). Pour dépister le SMT-SL, la réalisation d’un score de risque Mayo-clinique en première intention puis de l’IHC semble la meilleure stratégie avec un coût inférieur pour la société. Cette attitude doit être adaptée aux ressources médico-économiques de chaque pays. Nos données montrent aussi que la composition du microenvironnement des TSs n’est pas liée au phénotype MMR mais à l’agressivité des lésions. Au sein de ce microenvironnement, nous suggérons que les macrophages, notamment de type M2, et les DCs jouent un rôle permissif à la croissance tumorale. L’immunothérapie ciblant la liaison PD-1/PD-L1 pourrait être une bonne option thérapeutique pour les CSs.