UPThèses

Le syndrome de Brugada (BrS) est une cardiopathie héréditaire à transmission autosomique dominante, se manifestant par une anomalie de l'ECG et un risque accru de mort subite. Les mutations retrouvées dans la sous-unité α du canal sodique cardiaque Nav1.5 chez certains patients entraînent un défaut d'adressage membranaire de ces canaux. Ceux-ci restent alors séquestrés dans des compartiments intracellulaires. L'étude de ces mutants se réduisant souvent à l'utilisation de traitements correcteurs, les mécanismes de rétention impliqués restent encore méconnus. L'objectif de ce travail est d'étudier des mutants Nav1.5 présentant un défaut d'adressage en tenant compte non seulement de l'hétérozygotie des patients BrS mais également de la présence de la sous unité régulatrice β1 prédominante dans le cœur. Des études fonctionnelles et biochimiques mettent en évidence un effet dominant négatif exercé par les mutants R1432G, L325R et S910L sur la densité de courant INa sauvage (WT). Cet effet nécessite la présence de la sous-unité β1 et passe par l'altération de l'adressage membranaire des formes WT. Ceci est la conséquence d'une interaction physique entre des sous-unités α mutantes et WT. D'autre part, les mutants étudiés présentent un profil de maturation lié aux N-glycosylations qui différent de celui des canaux WT. Nos données suggèrent que ces canaux peuvent emprunter (i) la voie classique d'adressage dans leur forme mature (ii) la voie dite non conventionnelle lorsqu'ils sont partiellement glycosylés. En conclusion, ces travaux mettent en évidence le rôle de la sous-unité β1 ainsi que l'implication des N-glycosylations dans la modulation de l'adressage des canaux Nav1.5

L'objectif de cette thèse était de développer et de caractériser un modèle de cellules souches cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire. Après avoir sélectionné et caractérisé une population de cellules souches d'origine mésenchymateuse, isolée à partir d'auricules humaines, exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d'immuno-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1. la caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs de la signalisation calcique et 2. l'étude de leur différenciation in vitro en parallèle à l'activité calcique intracellulaire. Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker. Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, Kv, NCX, s'expriment durant la différenciation. L'enregistrement de l'activité calcique (via une sonde optogénétique) montre la présence d'oscillations calciques qui évoluent en fréquence et en intensité pendant la différenciation. Les stocks-IP3 sensibles et l'échangeur NCX joueraient un rôle fondamental. Nous avons ensuite étudié l'importance du canal BKCa et des récepteurs sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+. L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-renouvellement mais n'affecte pas la migration. Quant à la S1P elle freine la prolifération et l'auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3. Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque.

Le calcium est un second messager qui participe à de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la migration, la différenciation, l’apoptose et la transmission de messagers neuronaux. Dans le modèle musculaire squelettique, le calcium est un acteur important dans le processus du couplage excitation-contraction. Il est également impliqué dans la myogenèse et dans les processus de réparation. Une dérégulation du calcium dans les cellules musculaires participe à leur dégénérescence comme il a été observé dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif de cette thèse a été par des approches innovantes d’optogénétique, d’explorer et de moduler des mécanismes fondamentaux dépendants du calcium tels que la migration, la fusion, la différenciation et la contraction dans différents modèles musculaires.
1- Dans un premier temps, l’effet de la stimulation de l’halorhodopsine (eNpHR) sur le contrôle du potentiel de membrane et sur le processus de migration de myoblastes C2C12 a été étudié. La transfection de eNpHR3.0 dans des myoblastes C2C12 a permis de générer des courants sortants diminuant le potentiel de membrane vers des valeurs stabilisées tout le long de la stimulation. Cette polarisation membranaire induit des élévations transitoires de calcium cytosolique, dépendant du canal TRPV2 localisé à la membrane plasmique. Après avoir démontré l’implication de TRPV2 dans les processus migratoires des myoblastes, les entrées de calcium induites par la stimulation lumineuse ont permis d’augmenter la migration TRPV2-dépendante des myoblastes C2C12.
2- Dans un second temps, l’impact de la stimulation par le canal rhodopsine 2 (ChR2) a été évalué pour le contrôle de l’activité calcique et sur les processus de différenciation dans des cultures primaires de myotubes murins. Après avoir caractérisé la signature calcique des cultures primaires de myotubes en différenciation avec la protéine fluorescente sensible au calcium GCaMP, un protocole de simulation optique a été développé pour reproduire la signature calcique spontanée de myotubes différenciés. En premier lieu, le contrôle de l’activité calcique par la stimulation optique de ChR2 a été confirmé au niveau d’une cellule unique ainsi qu’à l’échelle d’une culture entière. Par la suite, l’application d’un protocole de stimulation optique en culture pendant la différenciation a permis de moduler les processus de différenciation tels que la fusion et la contraction des myotubes primaires.
3- La signature calcique de cellules dystrophiques représentatives de la DMD a été explorée dans deux modèles cellulaires différents composés de cultures primaires isolées de souris mdx et de cellules musculaires humaines dérivés d’hiPSCs provenant de patients DMD. Des dérégulations de la signature calcique ont été observées dans ces deux modèles dystrophiques. Une exploration fonctionnelle a été réalisée sur les cellules musculaires dérivées d’hiPSCs au travers de stimulations électriques, pharmacologiques et optiques démontrant leur capacité à développer un phénotype musculaire et confirmant leur intérêt potentiel pour la modélisation de maladies telles que la DMD.
Ces travaux ouvrent des perspectives sur l’utilisation de l’optogénétique pour évaluer la fonctionnalité des cellules et pour moduler certains processus cellulaires pour de futures applications thérapeutiques.