UPThèses

Le calcium est un messager intracellulaire secondaire impliqué dans le contrôle de nombreux processus biologiques. Un mauvais contrôle de sa concentration peut conduire à la mort cellulaire. Pour ce faire, le Ca2 + est stocké dans les compartiments intracellulaires tel que le réticulum endoplasmique (RE). La mucoviscidose (CF) est une maladie génétique résultant de la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Chez une majorité de patients (92%), il est retrouvé une délétion d'un résidu phénylanine en position 508. La protéine ainsi délétée (F508del-CFTR) se retrouve retenue dans le RE par des protéines chaperonnes dépendantes du Ca2 + Dans un premier temps, nous avons caractérisé et comparé l'homéostasie calcique des cellules épithéliales CF et non FC, précisément au niveau : du ER, de la membrane plasmique et pour finir au niveau des mitochondries. Puis, nous avons regarder les conséquences sur l'homéostasie calcique de la correction du défaut de l'adressage défectueux de la protéine F508del-CFTR (correction pharmacologique ( miglustat) ou par une incubation 24 heures à 27 ° C) . Nous avons mis en évidence l'implication de 3 isoformes de recepteurs à l'IP3 (RIP3),des canaux calciques membranaires TRPC1 et TRPC6, ainsi qu'une participation des mitochondries. Dans la mucoviscidose, les RIP3s, les canaux TRPC6 apparaissent suractivés. Il semble que le contenu en cholestérol de la membrane plasmique joue un rôle primordial dans la régulation du TRPC6. tandis que le pouvoir tampon calcique des mitochondries apparaît diminué dans les cellules CF. Le contrôle du signal calcique des cellules mucovisidosiques apparaît fortement perturbé. Ces perturbations du signal calcique pourraient avoir de nombreuses implications dans la physiopathologie de la mucoviscidose, notamment au niveau de l'état inflammatoire des cellules mucoviscidosiques.

Agelanthus dodoneifolius est une plante de la pharmacopée africaine utilisée en médecine traditionnelle pour le traitement de pathologies cardiovasculaires. Un fractionnement bioguidé a permis d'isoler une nouvelle dihydropyranone : baptisée Dodonéine (Ddn), elle possède des propriétés hypotensives et vasorelaxantes chez le rat. L'objectif de la thèse est de caractériser la ou les cible(s) moléculaire(s) de la Ddn dans le système cardiovasculaire et d'identifier un dérivé plus sélectif. Nos résultats montrent que la Ddn bloque le courant calcique de type L des cardiomyocytes ventriculaires de rat et des cellules musculaires lisses vasculaires, d'environ 30% avec une IC50 de l'ordre du µM. La Ddn apparaît comme un nouveau bloqueur des canaux calciques de type L avec des propriétés électrophysiologiques qui lui sont propres. Une étude biochimique a montré que l'anhydrase carbonique (CA) est également inhibée par la Ddn, et nous avons caractérisé l'expression de plusieurs isoformes au sein de muscle lisse vasculaire : CA II, III, XIII et XIV. Nos travaux précisent que leur inhibition augmente le pH intracellulaire, pouvant conduire à l'activation des canaux KCa. Ainsi, la Ddn induit un effet vasorelaxant en inhibant deux protéines: les canaux calciques et l'anhydrase carbonique. Nous avons ensuite démontré que les dérivés de la Ddn nouvellement synthétisés sont aussi vasorelaxants ; toutefois, le plus efficace, la Ddn-Bicyclique-OH, ne concurrence pas les bloqueurs calciques utilisés en clinique. Cependant, l'effet vasorelaxant de la Ddn et Ddn-Bc-OH caractérisé sur des artères systémiques humaines est en accord avec l'utilisation de la plante en médecine traditionnelle.

Les phospholipases C (PLC) sont des enzymes indispensables dans la transmission des signaux cellulaires via l’hydrolyse des phospholipides membranaires et régulent, par exemple, l’activité de protéines et de canaux ioniques. Les PLC génèrent des seconds messagers tels que le DAG et l’IP3 qui vont respectivement activer la protéine kinase C et augmenter le Ca2+ intracellulaire, deux mécanismes impliquées dans l’activité du canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), dont la mutation du gène dans la mucoviscidose est liée à la perte de l’expression et/ou de fonction du canal. L’objectif du projet est d’étudier dans quelle mesure les PLC peuvent jouer un rôle dans l’activité du canal CFTR. Nous avons mis en évidence une implication des phospholipase C dans la sécrétion d’ions chlorures dépendante de l’activité du canal CFTR WT et CFTR F508del corrigé à la membrane par la température. Ainsi nous avons montré que les PLC participent au maintien de la sécrétion chlorure dans le temps via l’activation d’un canal chlorure autre que CFTR. Par ailleurs nous avons identifié la PLCγ1 et la PLCβ3 comme étant nécessaires à l’activation maximale du courant CFTR dépendant, possiblement via des interactions avec les protéines NHERF et SHANK 2, deux protéines qui régulent l’activité de CFTR. Nous avons aussi montré que la PLCβ3 intervient dans la sécrétion d’ions chlorure par les canaux chlorures activés par le calcium (CaCC). Enfin, les PLC régulent l’homéostasie calcique dans les cellules bronchiques et nous avons mis en évidence des différences de régulation du canal calcique TRPV6 entre les cellules qui expriment le CFTR WT et celles qui expriment le CFTR F508del par un mécanisme impliquant les PLC. En résumé nous avons montré que les phospholipases C, et notamment la PLCβ3, jouent un rôle dans l’activité de trois conductances chlorure mais aussi dans la régulation de l’homéostasie calcique dans les cellules épithéliales bronchiques, résultats qui pourraient être exploités dans les recherches visant à améliorer la sécrétion de fluide dans le contexte de la mucoviscidose.

Les acides gras saturés (AGS) altèrent la fonctionnalité des organites dans de nombreux types cellulaires. Il a été proposé que ce processus, également nommé lipointoxication, puisse être responsable de plusieurs pathologies humaines telles que le diabète de Type 2. Au niveau cellulaire, l'accumulation d'AGS est associée à une augmentation du taux de saturation des phospholipides (PL) membranaires, les composants majoritaires des membranes des organites, mais également du taux de céramides, impliqués dans l'induction de l'apoptose. Dans une première partie de ce travail, nous avons étudié, chez le modèle cellulaire simple Saccharomyces cerevisiae, la contribution relative des PL saturés et des céramides à la cytotoxicité des AGS. Nous avons pu démontrer que les céramides agissaient à des étapes précoces de la voie de sécrétion, alors que les PL saturés impactaient des étapes plus tardives en altérant en particulier la formation de vésicules de sécrétion. Parallèlement, nous avons également constaté que le taux d'AGS était significativement augmenté dans les PL membranaires des patients atteints d'une maladie génétique, la mucoviscidose. La mutation la plus fréquente responsable de cette maladie, résulte en la rétention de la protéine correspondante dans le réticulum endoplasmique. Des molécules pharmacologiques, capables de corriger le trafic de la protéine à sa destination finale ont été isolées in vitro, mais des limitations importantes ont pu être observées lors des tests cliniques. Nous proposons dans le présent manuscrit que la lipointoxication liée aux AGS pourrait être un écueil important à l'utilisation des correcteurs actuels pour le traitement de la mucoviscidose.

Les canaux TRP (Transient Receptor Potential) sont des acteurs clés de l'homéostasie calcique. Plusieurs de ces canaux interviennent dans l'influx calcique des cellules épithéliales bronchiques, notamment TRPC6, qui est impliqué dans un couplage fonctionnel avec le canal Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR). Les mutations du CFTR (F508del et G551D) sont à l'origine de la mucoviscidose (Cystic Fibrosis (CF)), qui aboutit à l'augmentation de l'influx calcique dans les cellules CF. L'objectif de ce travail a été d'étudier l'implication des canaux TRP dans la dérégulation de l'influx calcique des cellules épithéliales bronchiques CF. Nous avons mis en évidence que CFTR régulait négativement l'activité de TRPC6, tandis que l'influx calcique via TRPC6 permettait de potentialiser l'activité du canal muté CFTR-G551D, activé au préalable par le VX-770. Nous proposons donc une nouvelle stratégie thérapeutique, combinant un potentiateur de CFTR et un activateur spécifique de TRPC6. Nous nous sommes ensuite intéressés au rôle des canaux TRPV, en particulier TRPV5 et TRPV6, dans l'influx calcique des cellules épithéliales bronchiques. Nous avons observé que l'influx Ca2+ constitutif, attribuable à ces deux canaux, était doublé dans les cellules CF, dû à une augmentation de l'activité de TRPV6. En effet, l'expression de la PLC-δ1, une enzyme régulant négativement TRPV6, est dramatiquement réduite dans les cellules CF. La correction de l'adressage du F508del-CFTR a permis de normaliser l'activité de TRPV6 sans restaurer l'expression de la PLC-δ1 dans les cellules CF, suggérant un contrôle plus complexe de TRPV6 dans les cellules épithéliales bronchiques.