UPThèses

Une souche de Staphylococcus warneri, possédant une activité anti-Legionella, a été décrite par notre équipe en 2005. Cette souche produit plusieurs peptides, dont l'un a fait l'objet d'un dépôt de brevet en 2006 pour son activité anti-Legionella, sous le nom de warnéricine RK. Deux autres peptides actifs, nommés δ-hémolysine I et II, sont des hémolysines produites par de nombreuses espèces de Staphylococcus, sans activité connue contre les bactéries. Ces trois peptides possèdent un spectre d'activité antimicrobien restreint au genre Legionella. Afin de comprendre cette spécificité d'action, l'objectif de cette étude a été de déterminer les propriétés biologiques et le mécanisme d'action de la warnéricine RK. Dans la première partie de ce travail, l'étude de l'activité de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I a montré que leur spectre d'activité est restreint au genre Legionella et à Bacillus megaterium. Les deux peptides ont des activités biologiques et des caractéristiques structurales similaires, ce qui laisse penser qu'ils possèdent un mécanisme d'action semblable. La seconde partie de ce travail a consisté en l'étude du mécanisme d'action de la warnéricine RK. L'approche utilisée a été d'analyser l'activité du peptide sur des membranes artificielles et naturelles. Les résultats ont permis de mettre en évidence que la warnéricine RK est capable de perméabiliser ces membranes en formant des canaux de taille variable. L'analyse de la structure tridimensionnelle par résonnance magnétique nucléaire a permis de montrer que la warnéricine RK, à l'image de la δ-hémolysine, adopte une structure en hélice α amphiphile au contact des membranes. L'ensemble des données obtenues sont en accord avec un mode d'action detergent-like, comme proposé dans la littérature pour la δ-hémolysine.Dans la dernière partie de ce travail, une souche de L. pneumophila résistante à l'action de la warnéricine RK a été isolée par pression de sélection. Les travaux menés ont permis d'étudier l'impact des modifications de l'enveloppe de L. pneumophila (sauvage vs résistant) sur l'action de la warnéricine RK et, plus particulièrement, celles des lipides membranaires. Les travaux ont montré que les bactéries résistantes à l'action du peptide sont enrichies en acides gras à chaîne courte et en acides gras branchés. Ces caractéristiques sont corrélées à une fluidité membranaire plus importante. L'ensemble des résultats obtenus a permis de montrer l'action de perméabilisation membranaire de la warnéricine RK sur L. pneumophila. Même si la forte sensibilité de Legionella reste encore mal comprise, il semble que celle-ci soit, en partie, due à une composition particulière de sa membrane.

Legionella est la bactérie à Gram négatif identifiée dans les épidémies de légionellose liées à la contamination des réseaux d'eau chaude et des tours aéroréfrigérantes. En France, où la maladie est soumise à déclaration obligatoire depuis 1987, plus un millier de cas sont recensés par an parmi lesquels 10 % s'avèrent mortels. Associée à un consortium des cellules microbiennes, Legionella se trouve attachée aux surfaces dans une matrice de polymères organiques et minéraux appelée biofilm. Dans cette structure, elle devient plus résistante aux procédés de désinfection que lorsqu'elle est sous forme libre. C'est dans ce contexte qu'ont été définis les objectifs de ce travail qui s'est articulé autour trois volets principaux : (1) le développement d'un outil analytique permettant l'étude de la dynamique des populations microbiennes dans l'eau et dans le biofilm d'un réseau d'eau chaude après différents traitements anti-Legionella, (2) le suivi de l'évolution de la flore totale procaryote et de Legionella en particulier dans l'eau et le biofilm après un traitement par choc thermique (70 °C pendant 30 minutes) et par un traitement chimique (biocide combiné à un biodispersant) et (3) la caractérisation de la diversité de Legionella dans le biofilm en relation avec la dynamique de la structure microbienne (bactérie et eucaryotes) du biofilm après ces deux traitements. Un pilote à l'échelle 1 constitué de deux boucles d'eau chaude similaires (boucles témoin et test) a été développé et contaminé par un biofilm naturel de Legionella. Les deux traitements testés (thermique et chimique) ont eu un effet transitoire. Un retour aux concentrations initiales en Legionella cultivables dans l'eau et dans le biofilm a été observé une semaine après l'application des traitements. Pour une des premières fois dans ce type d'études, l'utilisation de méthodes moléculaires de pointe (séquençage, SSCP) ont permis d'identifier la diversité de Legionella (cinq espèces dont quatre sont des pathogènes opportunistes) dans le biofilm des réseaux d'eau chaude et de caractériser la flore microbienne qui accompagne Legionella dans cette matrice (protéobactéries, amibes, flagellés, champignons, alvéolates). Ce travail apporte ainsi des éléments novateurs en termes d'outils permettant de tester les traitements anti- Legionella, de méthodes analytiques et de connaissance sur le consortium microbien qui accompagne Legionella dans le biofilm.

Legionella pneumophila, l'agent responsable d'une pneumonie sévère atypique chez l'homme, appelée maladie du légionnaire, est ubiquitaire dans les environnements aquatiques. Les traitements généralement appliqués dans les réseaux d'eau afin d'éradiquer cette bactérie sont souvent suivis d'une recolonisation rapide de cette bactérie. Un des facteurs pouvant expliquer cette recolonisation peut être l'état Viable Non Cultivable (VBNC).L'objectif de nos travaux a été d'étudier la survie de L.pneumophila après des traitements oxydant et thermique et notamment d'étudier l'état VBNC. Dans un premier temps nous avons réalisé un traitement monochloramine et un traitement thermique sur une suspension de légionelles. Nous avons observé que le traitement par 20 mg/L de monochloramine ainsi que celui à 57,5°C, conduisaient à la formation de VBNC chez L. pneumophila. De plus ces bactéries peuvent persister dans cet état pendant au moins 169 jours après traitement.Dans un second temps, une étude partielle des protéines exprimées à l'état VBNC a été menée. Nous avons montré que l'expression de plusieurs protéines, impliquées dans les voies de production d'énergie, de synthèse protéique et dans la virulence, était augmentée d'un facteur supérieur ou égale à deux par comparaison avec des bactéries ayant subies un stress monochloramine ou une carence en nutriments.Dans un troisième temps, la recherche d'un facteur de ressuscitation Rpf a été entreprise chez L. pneumophila. Un gène Rpf-like, possédant 33% d'identité et 51% de similarité avec celui de Salmonella, a été découvert. Ce gène a été cloné mais la protéine recombinante obtenue n'a pas conduit à un retour à la cultivabilité des cellules.