UPThèses

Le syndrome CHARGE (CS) est une maladie génétique rare caractérisée par de nombreuses anomalies congénitales, majoritairement causées par des altérations de novo du gène CHD7. Celui-ci code pour une protéine à chromodomaines, impliquée dans le remodelage ATP-dépendant de la chromatine. La grande majorité des altérations de CHD7 consiste en allèles nuls tels que des délétions, des substitutions non-sens ou des décalages du cadre de lecture. Nous avons réalisé le premier diagnostic moléculaire d’un patient Indonésien atteint du CS, en étudiant un panel de gènes (CHD7, EFTUD2, et HOXA1) par NGS (next-generation sequencing). Nous avons identifié une nouvelle mutation non-sens hétérozygote dans l’exon 34 du gène CHD7 (c.7234G>T ou p.Glu2412Ter). Par ailleurs, il n'existe pas d’analyse fonctionnelle qui permettrait de caractériser la pathogénicité des variants de la protéine CHD7 rencontrés chez des patients. C’est pourquoi l’objectif de ce travail est de mettre au point un test fonctionnel de la protéine CHD7, sous forme sauvage ou mutée. Pour cela, nous avons généré par mutagénèse dirigée des vecteurs codant pour trois variants faux-sens de CHD7 et le variant présentant une insertion de cinq acides aminés. Ensuite, les protéines CHD7, sous forme sauvage ou variante, ont été surexprimées dans la lignée HeLa. L’expression des protéines a été mise en évidence par western blot et par immunofluorescence. Pour étudier la fonctionnalité de CHD7, nous avons quantifié par RT-qPCR les transcrits de cinq gènes (l’ADNr 45S, SOX4, SOX10, MYRF, et ID2), dont la transcription est selon le littérature régulée par CHD7. Nous avons observé que l’expression de CHD7 sauvage entraînait une diminution significative et reproductible des quantités de transcrits correspondant à tous les gènes rapporteurs. Par contre, l’expression des quatre allèles variants de CHD7 n’avait aucun impact, ce qui suggère que ces variants ne sont pas fonctionnels. Par ailleurs, nous avons appliqué notre test biologique dans des cellules de la lignée SH-SY5Y, pour lesquelles nous avons introduit une mutation faux-sens dans le génome en utilisant la technique CRISPR/Cas9. Lorsque ce variant était exprimé, les niveaux de transcription des cinq gènes rapporteurs n’étaient pas significativement différents de ceux observés dans les cellules où les deux allèles de CHD7 avaient été invalidés. Par conséquent, les variants étudiés peuvent être répertoriés comme résultant de mutations causales du CS.

La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresser vers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à la dégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisation.