UPThèses

Les maladies du bois de la vigne, causées par des champignons nécrotrophes, ont un impact considérable sur l'économie viticole au niveau mondial. En effet, tous les cépages Vitis vinifera cultivés actuellement présentent une sensibilité plus ou moins forte à ces champignons. Dans le but d'établir un test rapide d'évaluation de la sensibilité de clones de vigne (nouvellement sélectionnés ou futures obtentions variétales) à Eutypa lata, le champignon responsable de l'Eutypiose, une recherche de marqueurs moléculaires de tolérance a été réalisée. Suite à l'infection in vivo et in vitro d'une douzaine de cépages de sensibilité différente par E. lata, plusieurs gènes candidats ont été identifiés comme marqueurs potentiels de la tolérance à la maladie à partir d'une étude transcriptomique. A l'aide d'un système innovant d'infection in vitro, le dialogue moléculaire sans contact physique entre des disques foliaires de V. vinifera et le mycélium d’E. lata a également été étudié chez les douze cépages. Cette étude a permis de mettre en évidence le rôle potentiel d'éliciteurs dans la mise en place des réponses de défenses. De plus, l'infection par E. lata régule différentiellement l'expression des gènes codant pour un transporteur d'hexoses et des invertases, ainsi que les activités invertasiques associées, chez les cépages de sensibilités variables. Les travaux de recherche présentées dans cette thèse ont ainsi permis l'identification des marqueurs de tolérance à l'Eutypiose et la mise au point d'un test d'infection in vitro efficace et fiable, permettant de diagnostiquer la sensibilité des futures créations variétales. De plus les résultats obtenus démontrent l'importance des éliciteurs dans la mise en place des défenses, de la régulation du transport et du métabolisme des sucres au cours de l'infection par E. lata.

La distribution des sucres est un processus clé dans le développement de la plante et cours des interactions plantes/microorganismes. Une recherche des acteurs moléculaires impliqués dans la répartition des ressources carbonées au cours de l'interaction avec le champignon nécrotrophe B. cinerea a été réalisée. Plusieurs familles de transporteurs de sucres et d'invertases ont été ciblées, permettant d'établir une cartographie des gènes régulés transcriptionnellement lors de l'interaction. Le rôle de certains gènes candidats a été étudié par une approche de génomique fonctionnelle afin de mettre en évidence une fonction biologique de l'allocation du carbone dans la résistance de la plante aux champignons nécrotrophes. Un système d'interaction simplifié, basé sur un dialogue moléculaire sans contact physique entre une culture cellulaire d'A. thaliana et B. cinerea, a été développé. Il a permis de mesurer les flux de sucres ainsi que les activités enzymatiques et métaboliques pour chaque partenaire. Nos résultats montrent que B. cinerea entraine une forte augmentation de l'activité invertasique pariétale dans les tissus infectés, indiquant qu'une transition source/puits a lieu. Plusieurs transporteurs de sucres sont différentiellement exprimés, certains d'entre eux modulant le devenir de l'interaction. L'activité d'absorption d'hexoses et le métabolisme primaire des cellules hôtes sont fortement stimulés, démontrant l'importance de la compétition pour les sucres à l'interface plante/agent pathogène. En conclusion, l'absorption des sucres alimente le métabolisme énergétique des cellules hôtes et participe aux mécanismes de défense de la plante.

Au cours des interactions plante/agent pathogène, la disponibilité en sucres est un des enjeux majeurs pour les deux partenaires. Il s'établit donc une compétition vis-à-vis des ressources carbonées entre l'agent pathogène hétérotrophe pour le carbone et la plante consommant de l'énergie pour se défendre. Les transporteurs de sucres sont les acteurs moléculaires qui interviennent dans cette compétition et probablement dans le devenir de l'interaction. L'objectif de cette étude est de déterminer l'implication des transporteurs de sucres au cours de l'interaction entre la plante modèle Arabidopsis thaliana et le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea. Parmi la famille des transporteurs d'hexoses (STPs) d'A. thaliana, l'expression du gène STP13 est régulée positivement durant l'infection par B. cinerea. Le rôle potentiel de STP13 au cours de cette interaction a donc été étudié à l'aide de plantes transgéniques (Knock-Out et surexpresseur). Le suivi du développement des symptômes et la mesure d'absorption du glucose ont permis de montrer des modifications phénotypiques entre les différents génotypes étudiés. Les résultats indiquent une corrélation entre le niveau d'expression de STP13, le transport de glucose et le développement du champignon, confortant ainsi le rôle de STP13 dans la tolérance face à B. cinerea. Les résultats préliminaires de l'étude du transport de glucose à l'échelle cellulaire montrent une inhibition dans des conditions mimant l'infection. Ces analyses ont été effectuées grâce à un modèle constitué d'une suspension cellulaire d'A. thaliana subissant un traitement éliciteur à partir d'un extrait protéique de B. cinerea. Nous nous sommes également intéressés au transport de saccharose à l'échelle de la plante infectée. Nos résultats suggèrent que l'inoculation par le champignon modifie les flux de saccharose classiquement observés créant ainsi une nouvelle force d'appel. Ainsi, la feuille infectée se comporte comme un nouveau puits. Ces travaux de recherche s'inscrivent dans la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes de transport des sucres qui permettra à terme d'agir sur les capacités de résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes.

Chez les plantes supérieures, la distribution des sucres au sein des cellules est assurée par des protéines membranaires appelées transporteurs. Plusieurs études montrent qu'en plus de leur implication dans le développement, celles-ci ont un rôle au cours des interactions plantes/pathogènes. Le génome de la vigne a permis d'identifier 69 séquences de transporteurs de sucres ainsi que 6 séquences d'intervases chez cette espèce. Le profil d'expression de ces différents gènes a été étudié dans plusieurs oragnaes ainsi qu'en réponse à une contrainte biotique. L'infection de feuilles par Botrytis cinerea a induit une surexpression du transporteur d'hexoses VvHT5 et de l'invertase pariétale VvcwINV1. L'induction des gènes de défense VvPR3 et VvBIG8.1 et la production de resvératrol ont également été mises en évidence. Une suspension cellulaire de vigne cv Chardonnay a été initiée. L'infection des cellules par B. cinerea a induit une surexpression de 3 gènes de transporteurs d'hexoses, VvHT1, -5, -13 , ainsi que de l'invertase pariétale VvcwINV1. L'induction de ces 4 gènes a également été observée en réponse à trois éliciteurs fongiques. Parallèlement à l'induction de ces gènes de transporteurs de sucres, une augmentation de l'influx de glucose a été mesurée dans les cellules élicitées. Ces données indiquent que les transporteurs d'hexoses et les invertases de vigne sont impliqués dans la mise en place des mécanismes de défense lors d'une infection par le champignon nécrotrophe B. cinerea ou lors d'une élicitation. La surexpression de certains gènes de transporteurs de sucres et/ou d'invertases dans des plantules de vigne pourrait démontrer leur rôle dans les phénomènes de tolérance.

Trois conditions expérimentales, in vitro, en serre et au vignoble, ont été utilisées pour produire des plantes saines et des plantes infectées par Eutypa lata. Chaque échantillon a été caractérisé par la notation des symptômes, le ré-isolement des champignons présents dans les parties lignifiées, et l' identification formelle du mycélium d'Eutypa lata par PCR. Cette caractérisation a permis de distinguer les plantes infectées avec symptômes (S+R+), des plantes infectées sans symptômes (S-R+), et des plantes saines (S-R-). L' expression de 15000 gènes de Vigne a été analysée à partir des feuilles de ces plantes grâce à des puces à ADN. La comparaison entre les plantes S+R+ et S-R- a révélé que 44% des gènes différentiellement exprimés et communs entre au moins 2 des 3 conditions sont déjà connus pour intervenir au cours d'une interaction plante/champignon, et que 21% des gènes sur-exprimés chez les plantes S+R+ sont impliqués dans des fonctions de défense. La comparaison entre les plantes S-R+ et S-R-, en serre et au vignoble, a permis l'identification de 17 gènes potentiellement utilisablespour le développement d' un outil de diagnostic précoce et non destructif. L'analyse combinée des résultats obtenus pour les comparaisons S+R+/S-R-, S-R+/S-R- et S+R+/S-R+, en serre et/ou au vignoble, a permis l'identification des gènes plus spécifiquement associés à la réponse à l'infection, à l'absence de symptômes ou à la présence de symptômes. Les profils d'expression de plusieurs gènes candidats ont été confirmés par RT-PCR et complétés avec les analyses de feuilles de vignes infectées par d'autres champignons pathogènes.