UPThèses

L'objectif de cette thèse était de développer et de caractériser un modèle de cellules souches cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire. Après avoir sélectionné et caractérisé une population de cellules souches d'origine mésenchymateuse, isolée à partir d'auricules humaines, exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d'immuno-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1. la caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs de la signalisation calcique et 2. l'étude de leur différenciation in vitro en parallèle à l'activité calcique intracellulaire. Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker. Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, Kv, NCX, s'expriment durant la différenciation. L'enregistrement de l'activité calcique (via une sonde optogénétique) montre la présence d'oscillations calciques qui évoluent en fréquence et en intensité pendant la différenciation. Les stocks-IP3 sensibles et l'échangeur NCX joueraient un rôle fondamental. Nous avons ensuite étudié l'importance du canal BKCa et des récepteurs sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+. L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-renouvellement mais n'affecte pas la migration. Quant à la S1P elle freine la prolifération et l'auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3. Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque.

Le syndrome de Brugada (BrS) est une cardiopathie héréditaire à transmission autosomique dominante, se manifestant par une anomalie de l'ECG et un risque accru de mort subite. Les mutations retrouvées dans la sous-unité α du canal sodique cardiaque Nav1.5 chez certains patients entraînent un défaut d'adressage membranaire de ces canaux. Ceux-ci restent alors séquestrés dans des compartiments intracellulaires. L'étude de ces mutants se réduisant souvent à l'utilisation de traitements correcteurs, les mécanismes de rétention impliqués restent encore méconnus. L'objectif de ce travail est d'étudier des mutants Nav1.5 présentant un défaut d'adressage en tenant compte non seulement de l'hétérozygotie des patients BrS mais également de la présence de la sous unité régulatrice β1 prédominante dans le cœur. Des études fonctionnelles et biochimiques mettent en évidence un effet dominant négatif exercé par les mutants R1432G, L325R et S910L sur la densité de courant INa sauvage (WT). Cet effet nécessite la présence de la sous-unité β1 et passe par l'altération de l'adressage membranaire des formes WT. Ceci est la conséquence d'une interaction physique entre des sous-unités α mutantes et WT. D'autre part, les mutants étudiés présentent un profil de maturation lié aux N-glycosylations qui différent de celui des canaux WT. Nos données suggèrent que ces canaux peuvent emprunter (i) la voie classique d'adressage dans leur forme mature (ii) la voie dite non conventionnelle lorsqu'ils sont partiellement glycosylés. En conclusion, ces travaux mettent en évidence le rôle de la sous-unité β1 ainsi que l'implication des N-glycosylations dans la modulation de l'adressage des canaux Nav1.5

Les courants IKr et IKs jouent un rôle fondamental dans le contrôle de la phase de repolarisation du potentiel d'action cardiaque chez de nombreuses espèces. Une prolongation excessive de la durée de la repolarisation constitue un mécanisme proarythmique, pouvant générer des torsades de pointe aboutissant à la mort subite du patient par fibrillation ventriculaire. Il est clairement montré aujourd'hui que les molécules de toutes classes pharmacologiques, peuvent générer ces troubles du rythme par inhibition de la composante IKr. Ceci a conduit à la naissance de la pharmacologie de sécurité, qui évalue en phase pré clinique, les effets de toutes molécules sur la repolarisation cardiaque et plus particulièrement sur le courant potassique IKr. Ces évaluations ne concernent pas le courant IKs, qui néanmoins, joue un rôle important dans la régulation de la durée du potentiel d'action. Partant de ces données, l'objectif de notre étude a été la mise en place d'un modèle cellulaire exprimant de façon stable le canal KCNQ1 / KCNE1 responsable du courant IKs. Les résultats publiés dans le British Journal of Pharmacology montrant la prolongation de l'intervalle QT de l'électrocardiogramme par un agent anticancéreux inhibant le courant IKs, la doxorubicine, justifie l'intérêt de ce modèle. Dans la dernière partie de notre étude, nous avons étudiés les conséquences d'une inhibition du courant IKs sur la réserve de repolarisation, en présence du courant sodique lent (INaL), présent dans des situations pathologiques telles que le syndrome du QT long de type 3 ou les périodes post infarctus, au cours desquelles la durée de la repolarisation est allongée.

Depuis plusieurs années, de nombreux travaux ont étayé la fonction endocrine du cœur. L'existence de systèmes hormonaux dans le tissu cardiaque plus particulièrement celui des peptides natriurétiques, a conféré au cœur la propriété de glande endocrine en plus de sa simple fonction de pompe. Le BNP constitue le second membre de peptides natriurétiques. Il est principalement secrété par les ventricules en réponse à une surcharge de pression ou de volume. Grâce à ses propriétés diagnostiques, thérapeutiques et pronostiques, ce peptide est actuellement considéré comme le marqueur hormonal de la décompensation cardiaque. A l'échelle des cardiomyocytes, le BNP semble être impliqué dans la modulation de l'homéostasie calcique, régulant ainsi la fonction contractile du cœur. Le but de notre étude est d'évaluer sur des cardiomyocytes normaux et hypertrophiés, la concentration plasmatique de BNP, le rôle des canaux calciques ventriculaires dans sa sécrétion et le profil d'expression de ce peptide ainsi que celui de ces récepteurs (NPR-A, -B et -C); De même, nous avons étudié l'effet autocrine du BNP sur le taux de calcium intracellulaire, sur la densité du courant calcique de type L (ICaL) et sur le potentiel d'action (PA) dans des cardiomyocytes normaux. En utilisant plusieurs approches, combinant les techniques d'ELISA, de RT-PCR, d'immunohistochimie, de cytofluorimétrie laser et de patch-clamp, nous avons pu mettre en évidence que les canaux calciques transmembranaires de type L moduleraient la sécrétion du BNP, qu'il existe une surexpression des récepteurs NPR-A et NPR-C dans l'hypertrophie cardiaque, et finalement nous avons démontré que le BNP module la libération de calcium intracellulaire, modifie le PA et diminue la densité du ICaL dans les cardiomyocytes normaux. En effet, dans notre modèle d'hypertrophie, nous avons montré que la concentration de BNP dans le sang et le milieu de culture est significativement augmenté, que cette augmentation est contrebalancée par la présence d'antagonistes calciques dans le milieu de culture des cardiomyocytes normaux et hypertrophiés ; De plus, l'expression génique des récepteurs NPR-A et -C est significativement augmenté dans les cardiomyocytes hypertrophiés et elle est en corrélation avec l'augmentation de la concentration plasmatique de BNP et son degré d'expression dans le myocarde ; finalement le BNP diminue la concentration de calcium intracellulaire, augmente la durée et la phase II du PA, réduit l'amplitude et le temps d'inactivation du ICaL, , augmente le courant de fenêtre et modifie la disponibilité d'activation et d'inactivation du canal calcique de type L. En conclusion, cette étude nous a permis de mettre en évidence une relation réciproque entre le BNP et l'homéostasie calcique, qui pourrait être responsable des effets autocrines et paracrines du BNP sur la fonction cardiaque normale et dans le remodelage myocardique en réponse à un stress hémodynamique.