UPThèses

Le ray-grass anglais (Lolium perenne L.) est une espèce fourragère importante pour l’alimentation des ruminants. Les sélectionneurs ont pour objectif d'améliorer la qualité du fourrage, son rendement, sa résistance à la sécheresse et aux maladies. La qualité et le rendement dépendent de facteurs génétiques et environnementaux et sont étroitement liés à la morphogenèse de la plante et à la date de récolte ce qui rend difficile le classement des génotypes selon leur qualité. La partie de la plante récoltée est composées de feuilles et de tiges au stade reproducteur. L’objectif de la thèse était de mieux comprendre les sources de variation de la qualité du fourrage au cours du développement de la plante. Premièrement, nous avons étudié la diversité génétique et saisonnière pour des caractères liés à la qualité. Nous avons utilisé une collection de 592 génotypes de ray-grass anglais phénotypés pour la digestibilité de la matière organique (OMD), la digestibilité des parois cellulaires (NDFD) et les composants de cette paroi cellulaire (cellulose, hémicellulose et lignine) sur 2 années au printemps à la date d'épiaison et en automne. Une forte interaction génotype x saison a été observée pour l'OMD et la NDFD, indiquant des différences dans le contrôle génétique de ces traits entre saisons. La variation d’OMD est expliquée à la fois par la teneur en paroi cellulaire (NDF) et par sa qualité. La variation de la NDFD au printemps s'explique principalement par la teneur en hémicellulose. Une augmentation de 1% de la teneur en hémicellulose dans la paroi cellulaire (HC.NDF) a entraîné une augmentation de 0,81% de la NDFD. En automne, la variation de la qualité s'explique principalement par la teneur en lignine dans la paroi cellulaire (ADL.NDF). Une diminution de 0,1 % de l'ADL.NDF a entraîné une augmentation de 0,41 % de la NDFD. Pris par saison, les différentes variables ont montré une forte héritabilité et certaines ont présenté une variation génétique plus élevée en automne qu'au printemps. Dans une étude d’association basée sur 503 gènes candidats, nous avons identifié des QTLs expliquant de 29% à 52% de la variance phénotypique des variables OMD et NDFD. Chaque marqueur expliquait de 1 à 7% de la variance. Aucun QTL identique n'a été identifié entre les saisons, mais au sein d'une même saison, certains QTLs étaient communs entre les traits de digestibilité et les traits de composition de la paroi cellulaire, confirmant l'importance de la concentration en hémicellulose pour la digestibilité au printemps et la concentration en lignine dans le NDF pour la digestibilité en automne. Dans un second temps, nous avons décrit la cinétique de croissance et de qualité de quatre génotypes contrastés pour la date d'épiaison et la qualité pendant deux saisons différentes (printemps et automne). Nous avons observé que le principal facteur expliquant la diminution de la qualité des feuilles avec la maturité était la sénescence des feuilles. Ce facteur exclut, la qualité des feuilles vertes diminue avec l'augmentation de la longueur des feuilles et de la proportion de gaines. La qualité des tiges était inférieure à celle des feuilles et diminuait fortement avec la maturité. La qualité de la tige et la vitesse à laquelle elle décroissait avec la maturité différait entre les génotypes, ce qui permet une sélection potentielle pour les génotypes ayant une meilleure qualité des tiges matures. Au printemps, le choix des génotypes à sélectionner diffère selon les objectifs de production de biomasse et de qualité. En automne, les plantes devraient être récoltées immédiatement après que la biomasse ait atteint un maximum afin d'obtenir la meilleure qualité. Finalement, nous suggérons d'introduire la qualité de la tige dans l'évaluation du fourrage au cours du processus de sélection et d'effectuer des mesures de la qualité au printemps et à l’automne.

Le déficit hydrique est l'un des facteurs abiotiques les plus importants, qui affecte gravement la croissance et le développement des plantes ainsi que le rendement des cultures. Chez Arabidopsis thaliana, les transporteurs de monosaccharides ESL (Early response to dehydration Six-Like) forment l'une des plus grandes sous-familles de transporteurs de sucre, cependant leurs fonctions biologiques ne sont pas encore élucidées. Notre analyse phylogénétique a révélé l'émergence de cette famille de gènes chez les Streptophytes, leur répartition en trois principaux groupes (ESL1, ESL2 et ESL3) ainsi que leur diversification qui est étroitement liée à l'évolution des plantes terrestres. Dans le but d'élucider la diversité fonctionnelle des AtESL dans le développement des plantes et leurs réponses aux stress abiotiques, le phénotypage de plantes sauvages Col-0 et mutantes esl a été effectué aux niveaux morphologique, physiologique, biochimique et moléculaire, dans des conditions d'arrosage et de carence en eau. Le profil d'expression des gènes ESL, en réponse au déficit en eau, a révélé l’induction de quatre d’entre eux et la répression de huit autres gènes. Afin de comprendre les rôles des transporteurs ESL induits par la carence en eau, quatre simples mutants d'insertion T-DNA ont été identifiés et caractérisés. L’absence de phénotypes marquants pour ces simples mutants, nous a conduit à créer par croisements génétiques dans différentes combinaisons, trois doubles et deux triples mutants esl. Grace à des tests de germination de graines des simples, doubles et triples mutants esl, nous avons fourni des preuves de leur sensibilité/résistance différentielle à la germination à l'ABA, au glucose, à la salinité et au froid. Pour mieux comprendre l'activité de transport de sucres de AtESL3.5 et de AtESL3.3, nous avons réalisé une expression hétérologue dans S. cerevisiae, ainsi que des essais de transport de sucres sur des vacuoles isolées de la plante. Finalement, en utilisant des constructions de fusion de protéines avec deux marqueurs fluorescents différents exprimées de façon transitoire dans des protoplastes isolés de feuilles de tabac agro-infiltrées, nous avons démontré que AtESL3.5 est localisé dans le tonoplaste.

Le calcium est un second messager qui participe à de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la migration, la différenciation, l’apoptose et la transmission de messagers neuronaux. Dans le modèle musculaire squelettique, le calcium est un acteur important dans le processus du couplage excitation-contraction. Il est également impliqué dans la myogenèse et dans les processus de réparation. Une dérégulation du calcium dans les cellules musculaires participe à leur dégénérescence comme il a été observé dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif de cette thèse a été par des approches innovantes d’optogénétique, d’explorer et de moduler des mécanismes fondamentaux dépendants du calcium tels que la migration, la fusion, la différenciation et la contraction dans différents modèles musculaires.
1- Dans un premier temps, l’effet de la stimulation de l’halorhodopsine (eNpHR) sur le contrôle du potentiel de membrane et sur le processus de migration de myoblastes C2C12 a été étudié. La transfection de eNpHR3.0 dans des myoblastes C2C12 a permis de générer des courants sortants diminuant le potentiel de membrane vers des valeurs stabilisées tout le long de la stimulation. Cette polarisation membranaire induit des élévations transitoires de calcium cytosolique, dépendant du canal TRPV2 localisé à la membrane plasmique. Après avoir démontré l’implication de TRPV2 dans les processus migratoires des myoblastes, les entrées de calcium induites par la stimulation lumineuse ont permis d’augmenter la migration TRPV2-dépendante des myoblastes C2C12.
2- Dans un second temps, l’impact de la stimulation par le canal rhodopsine 2 (ChR2) a été évalué pour le contrôle de l’activité calcique et sur les processus de différenciation dans des cultures primaires de myotubes murins. Après avoir caractérisé la signature calcique des cultures primaires de myotubes en différenciation avec la protéine fluorescente sensible au calcium GCaMP, un protocole de simulation optique a été développé pour reproduire la signature calcique spontanée de myotubes différenciés. En premier lieu, le contrôle de l’activité calcique par la stimulation optique de ChR2 a été confirmé au niveau d’une cellule unique ainsi qu’à l’échelle d’une culture entière. Par la suite, l’application d’un protocole de stimulation optique en culture pendant la différenciation a permis de moduler les processus de différenciation tels que la fusion et la contraction des myotubes primaires.
3- La signature calcique de cellules dystrophiques représentatives de la DMD a été explorée dans deux modèles cellulaires différents composés de cultures primaires isolées de souris mdx et de cellules musculaires humaines dérivés d’hiPSCs provenant de patients DMD. Des dérégulations de la signature calcique ont été observées dans ces deux modèles dystrophiques. Une exploration fonctionnelle a été réalisée sur les cellules musculaires dérivées d’hiPSCs au travers de stimulations électriques, pharmacologiques et optiques démontrant leur capacité à développer un phénotype musculaire et confirmant leur intérêt potentiel pour la modélisation de maladies telles que la DMD.
Ces travaux ouvrent des perspectives sur l’utilisation de l’optogénétique pour évaluer la fonctionnalité des cellules et pour moduler certains processus cellulaires pour de futures applications thérapeutiques.

Les plantes vivent en étroite relation avec des populations complexes de microorganismes, y compris des espèces de rhizobactéries communément appelées rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (PGPR). Les PGPR conférèrent aux plantes une meilleure croissance et tolérance aux stress biotiques et abiotiques mais les mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus restent largement inconnus. En utilisant un système expérimental in vitro, la plante modèle Arabidopsis thaliana et la souche PGPR bien caractérisée Pseudomonas simiae WCS417r, nous avons réalisé un ensemble complet d'analyses phénotypiques, d’expressions géniques et biochimiques. Nos résultats montrent que PsWCS417r induit des modifications transcriptionnelles majeures du transport du sucre et d'autres processus biologiques clés liés à la croissance, au développement et à la défense des plantes. En utilisant une approche de génétique inverse, nous avons également démontré que AtSWEET11 et AtSWEET12, deux gènes transporteurs de sucre dont l'expression est réprimée par les souches bactériennes étudiées chez Arabidopsis thaliana, sont fonctionnellement impliqués dans les effets favorisant la croissance et le développement des plantules. Nos résultats révèlent que la régulation du transport de sucres joue un rôle important dans les effets bénéfiques des interactions plantes-rhizobactéries. Nous avons étendu notre étude à deux autres souches de PGPR (Pseudomonas fluorescens PICF7, Burkholderia phytofirmans PsJN) et à une autre souche non-PGPR (Escherichia coli DH5α). Ces trois souches bactériennes sont capables de modifier elles aussi l’expression de plusieurs gènes codant des transporteurs de sucre (essentiellement des gènes des familles AtSWEET et AtERD6-like), soit dans les racines, soit dans les parties aériennes des plantules d’Arabidopsis. Globalement, nos résultats révèlent une régulation transcriptionnelle conservée ou spécifique de certains gènes codants pour des transporteurs de sucres lors des interactions plante-PGPR. Enfin, nous avons effectué l'identification et la caractérisation d'une souche Bacillus megaterium, RmBm31, isolée de nodules racinaires de la légumineuse Retama monosperma. Notre étude révèle que RmBm31 est une bactérie endophyte produisant de l'IAA et possédant un grand nombre de gènes associés à des caractères favorisant la croissance des plantes. En utilisant la plante modèle Arabidopsis, nous avons démontré que cette souche présente des effets bénéfiques sur la croissance et le développement des plantules via la production de composés volatils. Ces effets semblent impliquer des mécanismes de signalisation indépendants de l'auxine.

Les phospholipases C (PLC) sont des enzymes indispensables dans la transmission des signaux cellulaires via l’hydrolyse des phospholipides membranaires et régulent, par exemple, l’activité de protéines et de canaux ioniques. Les PLC génèrent des seconds messagers tels que le DAG et l’IP3 qui vont respectivement activer la protéine kinase C et augmenter le Ca2+ intracellulaire, deux mécanismes impliquées dans l’activité du canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), dont la mutation du gène dans la mucoviscidose est liée à la perte de l’expression et/ou de fonction du canal. L’objectif du projet est d’étudier dans quelle mesure les PLC peuvent jouer un rôle dans l’activité du canal CFTR. Nous avons mis en évidence une implication des phospholipase C dans la sécrétion d’ions chlorures dépendante de l’activité du canal CFTR WT et CFTR F508del corrigé à la membrane par la température. Ainsi nous avons montré que les PLC participent au maintien de la sécrétion chlorure dans le temps via l’activation d’un canal chlorure autre que CFTR. Par ailleurs nous avons identifié la PLCγ1 et la PLCβ3 comme étant nécessaires à l’activation maximale du courant CFTR dépendant, possiblement via des interactions avec les protéines NHERF et SHANK 2, deux protéines qui régulent l’activité de CFTR. Nous avons aussi montré que la PLCβ3 intervient dans la sécrétion d’ions chlorure par les canaux chlorures activés par le calcium (CaCC). Enfin, les PLC régulent l’homéostasie calcique dans les cellules bronchiques et nous avons mis en évidence des différences de régulation du canal calcique TRPV6 entre les cellules qui expriment le CFTR WT et celles qui expriment le CFTR F508del par un mécanisme impliquant les PLC. En résumé nous avons montré que les phospholipases C, et notamment la PLCβ3, jouent un rôle dans l’activité de trois conductances chlorure mais aussi dans la régulation de l’homéostasie calcique dans les cellules épithéliales bronchiques, résultats qui pourraient être exploités dans les recherches visant à améliorer la sécrétion de fluide dans le contexte de la mucoviscidose.

Dans un contexte de fluctuation des prix des intrants et d’une demande croissante en produits à base de lait de chèvre issus de pratiques respectueuses de l’environnement et des animaux, le pâturage peut retrouver une place plus importante dans l’alimentation des chèvres laitières. D’après la synthèse bibliographique, les facteurs de variation de l’ingestion et des performances au pâturage ont été très peu étudiés chez les chèvres laitières en conditions tempérées. L’objectif de la thèse a été de comprendre quelle est l’influence des pratiques de gestion du pâturage (disponibilité en herbe et en temps pour pâturer) sur la régulation de l’ingestion et les performances des chèvres laitières, dans le but d’affiner les recommandations aux éleveurs et d’élaborer les bases d’un modèle de prévision de l’ingestion. D’après les 6 essais réalisés : (1) les chèvres recevant entre 0,6 et 1,0 kg/j de compléments s’adaptent à des restrictions de temps d’accès de 11 à 6 h/j, en augmentant leur vitesse d’ingestion et surtout le pourcentage du temps passé à pâturer jusqu’à 95 % du temps d’accès, (2) les chèvres recevant 0,6 kg de concentrés et un temps d’accès d’au moins 11 h/j peuvent s’adapter à une restriction de quantité d’herbe offerte jusqu’à 2,3-2,6 kg MS/chèvre/j, (3), le poids vif et la production laitière sont des paramètres déterminant de la quantité d’herbe ingérée alors que la parité et le stade de lactation n’ont pas montré d’effet significatif. Ce travail a permis d’établir les premières lois de réponse d’ingestion, de production laitière et d’adaptation comportementale des chèvres laitières à des variations de temps d’accès et de quantité d’herbe offerte au pâturage.

L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle des transporteurs de saccharose dans les racines d’A. thaliana pour mieux comprendre la répartition du carbone dans la plante entière. Nous nous sommes focalisés sur l’étude des deux principaux transporteurs de saccharose exprimés dans les racines : AtSUC1 et AtSUC2. Une étude du mutant KO suc1 et une étude des plantes greffées présentant la mutation KO du gène AtSUC2 uniquement dans les racines ont été réalisées sur des plantes au stade adulte (30 à 32 jours après semis) cultivées en rhizobox. De plus, les localisations de l’expression des gènes et des protéines de ces transporteurs ont été réalisées dans les racines de plantes adultes pour la première fois. La localisation de l’expression d’AtSCU1 dans les pointes racinaires, nous a permis de conclure sur un rôle potentiel d’AtSUC1 dans le déchargement du saccharose du phloème dans les zones de croissance des racines et/ou un rôle potentiel de senseur du signal glucidique ou du déficit hydrique, probablement en lien avec l’ABA. Les résultats montrent qu’AtSUC2 aurait un rôle dans le développement racinaire, certainement via le déchargement du saccharose du phloème dans les zones d’élongation des racines et dans le rechargement du phloème le long des racines (notamment dans les départs de racines latérales). De plus, AtSUC2 pourrait avoir un rôle dans l’augmentation locale d’hexoses liée à l’émergence des racines latérales. Enfin, nos résultats indiquent une contradiction entre la localisation de l’expression du gène AtSUC2 retrouvée dans le parenchyme cortical et la localisation de la protéine qui n’est pas retrouvée dans ces cellules. Néanmoins les deux approches s’accordent sur la localisation dans les cellules compagnes.

Le vieillissement est un processus physiologique au cours duquel l’ensemble de l’organisme voit son fonctionnement modifié. Il s’agit d’un remodelage génotypique et phénotypique, en lien avec le stress oxydatif. Les molécules antioxydantes comme les composés phénoliques (CP) ont pris une place importante dans la diète humaine, à titre de compléments alimentaires et/ou à titre thérapeutique. Toutefois, les conséquences d’un usage à long terme de ces molécules visant à reverser les effets du vieillissement sur les fonctions organiques, restent encore mal élucidées. Dans ce contexte, et compte tenu de notre intérêt pour le cœur, le rein et le microbiote intestinal, l’objectif de cette thèse est d’évaluer, sur de jeunes rats mâles, les effets des CP administrés à différentes concentrations, pendant quatorze mois. Les groupes traités par les CP ont montré une préservation, avec l’âge, de la performance cardiaque par rapport aux témoins non traités. De plus, les myocardes de rats âgés traités ont présenté de moindres signes d’inflammation, de fibrose et d’apoptose que les témoins. Ces modifications sont soutenues par un remodelage du niveau d’expression protéique des marqueurs de l’hypertrophie et du stress oxydatif, et des résultats préliminaires suggèrent une activation du courant potassique KATP en présence des CP sur les myofibroblastes. Le tissu rénal conserve son architecture normale avec l’âge chez tous les groupes. Enfin, les métabolites issus des CP ont montré une modulation sélective du microbiote intestinal vers un phénotype sain. Nos travaux montrent dans un modèle murin qu’une consommation régulière de CP permet de préserver le cœur, les reins et le microbiote du remodelage lié au vieillissement.

Les maladies du bois de la vigne, causées par des champignons nécrotrophes, ont un impact considérable sur l'économie viticole au niveau mondial. En effet, tous les cépages Vitis vinifera cultivés actuellement présentent une sensibilité plus ou moins forte à ces champignons. Dans le but d'établir un test rapide d'évaluation de la sensibilité de clones de vigne (nouvellement sélectionnés ou futures obtentions variétales) à Eutypa lata, le champignon responsable de l'Eutypiose, une recherche de marqueurs moléculaires de tolérance a été réalisée. Suite à l'infection in vivo et in vitro d'une douzaine de cépages de sensibilité différente par E. lata, plusieurs gènes candidats ont été identifiés comme marqueurs potentiels de la tolérance à la maladie à partir d'une étude transcriptomique. A l'aide d'un système innovant d'infection in vitro, le dialogue moléculaire sans contact physique entre des disques foliaires de V. vinifera et le mycélium d’E. lata a également été étudié chez les douze cépages. Cette étude a permis de mettre en évidence le rôle potentiel d'éliciteurs dans la mise en place des réponses de défenses. De plus, l'infection par E. lata régule différentiellement l'expression des gènes codant pour un transporteur d'hexoses et des invertases, ainsi que les activités invertasiques associées, chez les cépages de sensibilités variables. Les travaux de recherche présentées dans cette thèse ont ainsi permis l'identification des marqueurs de tolérance à l'Eutypiose et la mise au point d'un test d'infection in vitro efficace et fiable, permettant de diagnostiquer la sensibilité des futures créations variétales. De plus les résultats obtenus démontrent l'importance des éliciteurs dans la mise en place des défenses, de la régulation du transport et du métabolisme des sucres au cours de l'infection par E. lata.

La caractérisation des réponses des plantes à la sécheresse est un enjeu actuel majeur. La gestion du carbone dans l’adaptation des végétaux aux contraintes environnementales requiert l’activité de transporteurs de monosaccharides ERD6-like (Early Response to Dehydration six-like), transporteurs impliqués dans la compartimentation subcellulaire des sucres et leur remobilisation à l’échelle de l’organisme. Le premier axe de la thèse a été dédié à l’analyse phylogénétique des ERD6-like par une approche de génomique évolutive. L’identification de 519 ERD6-like dans les protéomes de 47 Embryophytes a permis de reconstituer l’histoire évolutive de cette famille en mettant en exergue des événements majeurs de duplications. Le second axe a permis d’établir la cartographie de l’expression des ERD6-like dans les différents organes d’Arabidopsis thaliana et a mené à l’identification de gènes exprimés de façon constitutive dans tous les organes, et d’autres, manifestant une expression préférentielle. Le troisième axe a permis d’étudier la réponse des ERD6-like à la carence en eau, dans les feuilles d’A. thaliana. Pour cela, le phénotypage morphologique, biochimique et physiologique des rosettes de plantes cultivées en conditions normales d’alimentation hydrique ou de stress hydrique a été réalisé. Le profil d’expression des AtERD6-like au cours de la cinétique de carence en eau a mis en évidence l’induction de quatre AtERD6-like en réponse au déficit hydrique. L’analyse de simples mutants pour ces gènes, a permis d’initier l’étude de la diversification fonctionnelle des ERD6-like d’A. thaliana.