UPThèses

Le contrôle nerveux des fonctions cardiaques implique des structures nerveuses centrales et périphériques dont l’action coordonnée conduit à la modulation des paramètres cardiaques telles que la fréquence cardiaque, la force contractile ou encore la vitesse de conduction de l’influx électrique. Ces mécanismes de régulation font notamment intervenir un ensemble de neurones localisés au sein du tissu cardiaque et formant le système nerveux intracardiaque (SNIC). Initialement, ces neurones furent considérés comme de simples relais parasympathiques. Toutefois, les études menées depuis une trentaine d’années suggèrent une organisation plus complexe de ce système. Elles proposent notamment que le SNIC serait impliqué dans la mise en place de boucles de régulation locales et indépendantes grâce à la présence de neurones sensoriels, d’interneurones ainsi que de neurones moteurs. Cette organisation complexe a notamment conduit certains à proposer le concept de « petit cerveau cardiaque ». Malgré l’ensemble des études menées jusqu’ici, la nature exacte des différents neurones composant les ganglions cardiaques n’a toutefois pas encore été déterminée et cela apparait d’autant plus important au regard de l’éventuelle implication de ces neurones dans la survenue et l’entretien de certaines pathologies cardiaques telles que les arythmies. Les progrès réalisés en matière d’ingénierie génétique offrent désormais la possibilité de décrypter précisément le fonctionnement de ce réseau neuronal intracardiaque et d’étudier plus minutieusement son implication dans les mécanismes pathologiques. Ainsi, l’objectif de cette thèse a donc été d’améliorer notre compréhension du SNIC en étudiant la complexité des cellules qui le composent. Pour cela, nous nous sommes tout d’abord consacrés à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle globale du SNIC de la souris. En effet, bien que ce modèle offre de nombreuses possibilités techniques pour investiguer le rôle et les propriétés des différents types de neurones cardiaques, très peu d’études avaient été conduites sur ce modèle jusqu’à présent. Nos résultats ont permis de déterminer que les ganglions cardiaques de cette espèce regroupent différents profils neurochimiques. De plus, l’étude de leurs propriétés électrophysiologiques nous a également conduit à identifier différents types de neurone caractérisés par des capacités de décharge ainsi que des potentiels d’action distincts. Dans un deuxième temps, nous nous sommes appuyés sur la technologie Cre-Lox pour nous focaliser sur l’étude d’une sous-catégorie précise de neurones cardiaques, identifiée par l’expression de la calbindine. Nous avons notamment montré que cette population présentait des propriétés morphologiques et électrophysiologiques distinctes des autres neurones cardiaques. Enfin, nous nous sommes également intéressés, au sein des ganglions cardiaques, aux cellules non neuronales exprimant le marqueur de pluripotence Sox2 et à leur capacité à initier des mécanismes de neurogenèse in vitro. Nos résultats suggèrent que ces cellules seraient capables de s’engager vers un phénotype neuronal en culture. Le SNIC murin semble donc présenter une complexité moléculaire et fonctionnelle similaire à celle retrouvée dans les autres espèces. L'identification de différentes classes de neurones et l'émergence de cellules potentiellement impliquées dans une neurogenèse au sein de ce système ouvre la voie à de futures études du rôle des différentes populations de neurones cardiaques dans la physiologie et de leur remodelage dans la physiopathologie cardiaque.

La lumière joue un rôle majeur dans les interactions plante-environnement de par son effet sur la morphogenèse des plantes. Les signaux lumineux qu’elle véhicule module la morphogenèse de la plupart des espèces végétales leur permettant d’éviter l’ombrage. C’est le cas en particulier du signal Rc:Rs, aussi appelé ζ, caractérisées par le rapport de flux de photon dans les longueurs d’onde à 660nm et 730nm. En traversant la végétation ce signal décroit et engendre des réponses de développement qui accroissent la taille des organes et/ou qui diminuent le nombre de ramifications. Pour établir les lois de réponse au ζ il est donc nécessaire de connaitre sa variabilité. Or dans ce domaine notre connaissance reste partielle notamment lorsqu’on s’intéresse à la morphogenèse d’une plante au sein du couvert car cela implique une meilleure compréhension des échanges lumineux entre les plantes voisines. Il s’agit notamment de prendre en compte l’aspect directionnel du signal de façon à capter l’environnement lumineux renvoyé par les plantes voisines vers une plante cible et ce quel que soit leur stade de développement. Cela implique de caractériser le ζ directionnel arrivant dans un angle de vue faible pour être en mesure de capter le signal renvoyé par les plantes et/ou organes de petite taille. L’objectif de cette thèse étaient double : (i) caractériser la variabilité de ζ directionnel mesuré dans un faible angle de vue sur des plantes de ray-grass aux architectures contrastées et (ii) tester la capacité des modèles existants à rendre compte de cette variabilité. Un dispositif de mesure du rayonnement directionnel dans un angle de vue de 3° a été conçu à cet effet. Des expérimentations ont été mises en place en serre afin de caractériser le signal ζ réfléchi par les plantes dans différentes configurations de densité (plante seule vs mini couvert), de distance entre la plante et le capteur et de condition de ciel (ciel diffus vs ciel clair). Nos résultats montrent une forte variabilité de ζ directionnel essentiellement liée à l’état de développement et aux conditions de ciel. Les simulations effectuées avec des modèles de transferts radiatifs existants montrent la nécessité de modéliser les signaux directionnels pour mieux caractériser les conditions d’éclairement de plantes dans les jeunes stades de développement du couvert et les réponses morphogénétiques qui en découlent. Enfin, une première approche de modélisation de ces signaux directionnel a été réalisé et les pistes d’amélioration discutées.

Le ray-grass anglais (Lolium perenne L.) est une espèce fourragère importante pour l’alimentation des ruminants. Les sélectionneurs ont pour objectif d'améliorer la qualité du fourrage, son rendement, sa résistance à la sécheresse et aux maladies. La qualité et le rendement dépendent de facteurs génétiques et environnementaux et sont étroitement liés à la morphogenèse de la plante et à la date de récolte ce qui rend difficile le classement des génotypes selon leur qualité. La partie de la plante récoltée est composées de feuilles et de tiges au stade reproducteur. L’objectif de la thèse était de mieux comprendre les sources de variation de la qualité du fourrage au cours du développement de la plante. Premièrement, nous avons étudié la diversité génétique et saisonnière pour des caractères liés à la qualité. Nous avons utilisé une collection de 592 génotypes de ray-grass anglais phénotypés pour la digestibilité de la matière organique (OMD), la digestibilité des parois cellulaires (NDFD) et les composants de cette paroi cellulaire (cellulose, hémicellulose et lignine) sur 2 années au printemps à la date d'épiaison et en automne. Une forte interaction génotype x saison a été observée pour l'OMD et la NDFD, indiquant des différences dans le contrôle génétique de ces traits entre saisons. La variation d’OMD est expliquée à la fois par la teneur en paroi cellulaire (NDF) et par sa qualité. La variation de la NDFD au printemps s'explique principalement par la teneur en hémicellulose. Une augmentation de 1% de la teneur en hémicellulose dans la paroi cellulaire (HC.NDF) a entraîné une augmentation de 0,81% de la NDFD. En automne, la variation de la qualité s'explique principalement par la teneur en lignine dans la paroi cellulaire (ADL.NDF). Une diminution de 0,1 % de l'ADL.NDF a entraîné une augmentation de 0,41 % de la NDFD. Pris par saison, les différentes variables ont montré une forte héritabilité et certaines ont présenté une variation génétique plus élevée en automne qu'au printemps. Dans une étude d’association basée sur 503 gènes candidats, nous avons identifié des QTLs expliquant de 29% à 52% de la variance phénotypique des variables OMD et NDFD. Chaque marqueur expliquait de 1 à 7% de la variance. Aucun QTL identique n'a été identifié entre les saisons, mais au sein d'une même saison, certains QTLs étaient communs entre les traits de digestibilité et les traits de composition de la paroi cellulaire, confirmant l'importance de la concentration en hémicellulose pour la digestibilité au printemps et la concentration en lignine dans le NDF pour la digestibilité en automne. Dans un second temps, nous avons décrit la cinétique de croissance et de qualité de quatre génotypes contrastés pour la date d'épiaison et la qualité pendant deux saisons différentes (printemps et automne). Nous avons observé que le principal facteur expliquant la diminution de la qualité des feuilles avec la maturité était la sénescence des feuilles. Ce facteur exclut, la qualité des feuilles vertes diminue avec l'augmentation de la longueur des feuilles et de la proportion de gaines. La qualité des tiges était inférieure à celle des feuilles et diminuait fortement avec la maturité. La qualité de la tige et la vitesse à laquelle elle décroissait avec la maturité différait entre les génotypes, ce qui permet une sélection potentielle pour les génotypes ayant une meilleure qualité des tiges matures. Au printemps, le choix des génotypes à sélectionner diffère selon les objectifs de production de biomasse et de qualité. En automne, les plantes devraient être récoltées immédiatement après que la biomasse ait atteint un maximum afin d'obtenir la meilleure qualité. Finalement, nous suggérons d'introduire la qualité de la tige dans l'évaluation du fourrage au cours du processus de sélection et d'effectuer des mesures de la qualité au printemps et à l’automne.

Le déficit hydrique est l'un des facteurs abiotiques les plus importants, qui affecte gravement la croissance et le développement des plantes ainsi que le rendement des cultures. Chez Arabidopsis thaliana, les transporteurs de monosaccharides ESL (Early response to dehydration Six-Like) forment l'une des plus grandes sous-familles de transporteurs de sucre, cependant leurs fonctions biologiques ne sont pas encore élucidées. Notre analyse phylogénétique a révélé l'émergence de cette famille de gènes chez les Streptophytes, leur répartition en trois principaux groupes (ESL1, ESL2 et ESL3) ainsi que leur diversification qui est étroitement liée à l'évolution des plantes terrestres. Dans le but d'élucider la diversité fonctionnelle des AtESL dans le développement des plantes et leurs réponses aux stress abiotiques, le phénotypage de plantes sauvages Col-0 et mutantes esl a été effectué aux niveaux morphologique, physiologique, biochimique et moléculaire, dans des conditions d'arrosage et de carence en eau. Le profil d'expression des gènes ESL, en réponse au déficit en eau, a révélé l’induction de quatre d’entre eux et la répression de huit autres gènes. Afin de comprendre les rôles des transporteurs ESL induits par la carence en eau, quatre simples mutants d'insertion T-DNA ont été identifiés et caractérisés. L’absence de phénotypes marquants pour ces simples mutants, nous a conduit à créer par croisements génétiques dans différentes combinaisons, trois doubles et deux triples mutants esl. Grace à des tests de germination de graines des simples, doubles et triples mutants esl, nous avons fourni des preuves de leur sensibilité/résistance différentielle à la germination à l'ABA, au glucose, à la salinité et au froid. Pour mieux comprendre l'activité de transport de sucres de AtESL3.5 et de AtESL3.3, nous avons réalisé une expression hétérologue dans S. cerevisiae, ainsi que des essais de transport de sucres sur des vacuoles isolées de la plante. Finalement, en utilisant des constructions de fusion de protéines avec deux marqueurs fluorescents différents exprimées de façon transitoire dans des protoplastes isolés de feuilles de tabac agro-infiltrées, nous avons démontré que AtESL3.5 est localisé dans le tonoplaste.

Les phospholipases C (PLC) sont des enzymes indispensables dans la transmission des signaux cellulaires via l’hydrolyse des phospholipides membranaires et régulent, par exemple, l’activité de protéines et de canaux ioniques. Les PLC génèrent des seconds messagers tels que le DAG et l’IP3 qui vont respectivement activer la protéine kinase C et augmenter le Ca2+ intracellulaire, deux mécanismes impliquées dans l’activité du canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), dont la mutation du gène dans la mucoviscidose est liée à la perte de l’expression et/ou de fonction du canal. L’objectif du projet est d’étudier dans quelle mesure les PLC peuvent jouer un rôle dans l’activité du canal CFTR. Nous avons mis en évidence une implication des phospholipase C dans la sécrétion d’ions chlorures dépendante de l’activité du canal CFTR WT et CFTR F508del corrigé à la membrane par la température. Ainsi nous avons montré que les PLC participent au maintien de la sécrétion chlorure dans le temps via l’activation d’un canal chlorure autre que CFTR. Par ailleurs nous avons identifié la PLCγ1 et la PLCβ3 comme étant nécessaires à l’activation maximale du courant CFTR dépendant, possiblement via des interactions avec les protéines NHERF et SHANK 2, deux protéines qui régulent l’activité de CFTR. Nous avons aussi montré que la PLCβ3 intervient dans la sécrétion d’ions chlorure par les canaux chlorures activés par le calcium (CaCC). Enfin, les PLC régulent l’homéostasie calcique dans les cellules bronchiques et nous avons mis en évidence des différences de régulation du canal calcique TRPV6 entre les cellules qui expriment le CFTR WT et celles qui expriment le CFTR F508del par un mécanisme impliquant les PLC. En résumé nous avons montré que les phospholipases C, et notamment la PLCβ3, jouent un rôle dans l’activité de trois conductances chlorure mais aussi dans la régulation de l’homéostasie calcique dans les cellules épithéliales bronchiques, résultats qui pourraient être exploités dans les recherches visant à améliorer la sécrétion de fluide dans le contexte de la mucoviscidose.

Dans un contexte de fluctuation des prix des intrants et d’une demande croissante en produits à base de lait de chèvre issus de pratiques respectueuses de l’environnement et des animaux, le pâturage peut retrouver une place plus importante dans l’alimentation des chèvres laitières. D’après la synthèse bibliographique, les facteurs de variation de l’ingestion et des performances au pâturage ont été très peu étudiés chez les chèvres laitières en conditions tempérées. L’objectif de la thèse a été de comprendre quelle est l’influence des pratiques de gestion du pâturage (disponibilité en herbe et en temps pour pâturer) sur la régulation de l’ingestion et les performances des chèvres laitières, dans le but d’affiner les recommandations aux éleveurs et d’élaborer les bases d’un modèle de prévision de l’ingestion. D’après les 6 essais réalisés : (1) les chèvres recevant entre 0,6 et 1,0 kg/j de compléments s’adaptent à des restrictions de temps d’accès de 11 à 6 h/j, en augmentant leur vitesse d’ingestion et surtout le pourcentage du temps passé à pâturer jusqu’à 95 % du temps d’accès, (2) les chèvres recevant 0,6 kg de concentrés et un temps d’accès d’au moins 11 h/j peuvent s’adapter à une restriction de quantité d’herbe offerte jusqu’à 2,3-2,6 kg MS/chèvre/j, (3), le poids vif et la production laitière sont des paramètres déterminant de la quantité d’herbe ingérée alors que la parité et le stade de lactation n’ont pas montré d’effet significatif. Ce travail a permis d’établir les premières lois de réponse d’ingestion, de production laitière et d’adaptation comportementale des chèvres laitières à des variations de temps d’accès et de quantité d’herbe offerte au pâturage.

L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle des transporteurs de saccharose dans les racines d’A. thaliana pour mieux comprendre la répartition du carbone dans la plante entière. Nous nous sommes focalisés sur l’étude des deux principaux transporteurs de saccharose exprimés dans les racines : AtSUC1 et AtSUC2. Une étude du mutant KO suc1 et une étude des plantes greffées présentant la mutation KO du gène AtSUC2 uniquement dans les racines ont été réalisées sur des plantes au stade adulte (30 à 32 jours après semis) cultivées en rhizobox. De plus, les localisations de l’expression des gènes et des protéines de ces transporteurs ont été réalisées dans les racines de plantes adultes pour la première fois. La localisation de l’expression d’AtSCU1 dans les pointes racinaires, nous a permis de conclure sur un rôle potentiel d’AtSUC1 dans le déchargement du saccharose du phloème dans les zones de croissance des racines et/ou un rôle potentiel de senseur du signal glucidique ou du déficit hydrique, probablement en lien avec l’ABA. Les résultats montrent qu’AtSUC2 aurait un rôle dans le développement racinaire, certainement via le déchargement du saccharose du phloème dans les zones d’élongation des racines et dans le rechargement du phloème le long des racines (notamment dans les départs de racines latérales). De plus, AtSUC2 pourrait avoir un rôle dans l’augmentation locale d’hexoses liée à l’émergence des racines latérales. Enfin, nos résultats indiquent une contradiction entre la localisation de l’expression du gène AtSUC2 retrouvée dans le parenchyme cortical et la localisation de la protéine qui n’est pas retrouvée dans ces cellules. Néanmoins les deux approches s’accordent sur la localisation dans les cellules compagnes.

Le vieillissement est un processus physiologique au cours duquel l’ensemble de l’organisme voit son fonctionnement modifié. Il s’agit d’un remodelage génotypique et phénotypique, en lien avec le stress oxydatif. Les molécules antioxydantes comme les composés phénoliques (CP) ont pris une place importante dans la diète humaine, à titre de compléments alimentaires et/ou à titre thérapeutique. Toutefois, les conséquences d’un usage à long terme de ces molécules visant à reverser les effets du vieillissement sur les fonctions organiques, restent encore mal élucidées. Dans ce contexte, et compte tenu de notre intérêt pour le cœur, le rein et le microbiote intestinal, l’objectif de cette thèse est d’évaluer, sur de jeunes rats mâles, les effets des CP administrés à différentes concentrations, pendant quatorze mois. Les groupes traités par les CP ont montré une préservation, avec l’âge, de la performance cardiaque par rapport aux témoins non traités. De plus, les myocardes de rats âgés traités ont présenté de moindres signes d’inflammation, de fibrose et d’apoptose que les témoins. Ces modifications sont soutenues par un remodelage du niveau d’expression protéique des marqueurs de l’hypertrophie et du stress oxydatif, et des résultats préliminaires suggèrent une activation du courant potassique KATP en présence des CP sur les myofibroblastes. Le tissu rénal conserve son architecture normale avec l’âge chez tous les groupes. Enfin, les métabolites issus des CP ont montré une modulation sélective du microbiote intestinal vers un phénotype sain. Nos travaux montrent dans un modèle murin qu’une consommation régulière de CP permet de préserver le cœur, les reins et le microbiote du remodelage lié au vieillissement.

Les maladies du bois de la vigne, causées par des champignons nécrotrophes, ont un impact considérable sur l'économie viticole au niveau mondial. En effet, tous les cépages Vitis vinifera cultivés actuellement présentent une sensibilité plus ou moins forte à ces champignons. Dans le but d'établir un test rapide d'évaluation de la sensibilité de clones de vigne (nouvellement sélectionnés ou futures obtentions variétales) à Eutypa lata, le champignon responsable de l'Eutypiose, une recherche de marqueurs moléculaires de tolérance a été réalisée. Suite à l'infection in vivo et in vitro d'une douzaine de cépages de sensibilité différente par E. lata, plusieurs gènes candidats ont été identifiés comme marqueurs potentiels de la tolérance à la maladie à partir d'une étude transcriptomique. A l'aide d'un système innovant d'infection in vitro, le dialogue moléculaire sans contact physique entre des disques foliaires de V. vinifera et le mycélium d’E. lata a également été étudié chez les douze cépages. Cette étude a permis de mettre en évidence le rôle potentiel d'éliciteurs dans la mise en place des réponses de défenses. De plus, l'infection par E. lata régule différentiellement l'expression des gènes codant pour un transporteur d'hexoses et des invertases, ainsi que les activités invertasiques associées, chez les cépages de sensibilités variables. Les travaux de recherche présentées dans cette thèse ont ainsi permis l'identification des marqueurs de tolérance à l'Eutypiose et la mise au point d'un test d'infection in vitro efficace et fiable, permettant de diagnostiquer la sensibilité des futures créations variétales. De plus les résultats obtenus démontrent l'importance des éliciteurs dans la mise en place des défenses, de la régulation du transport et du métabolisme des sucres au cours de l'infection par E. lata.

La caractérisation des réponses des plantes à la sécheresse est un enjeu actuel majeur. La gestion du carbone dans l’adaptation des végétaux aux contraintes environnementales requiert l’activité de transporteurs de monosaccharides ERD6-like (Early Response to Dehydration six-like), transporteurs impliqués dans la compartimentation subcellulaire des sucres et leur remobilisation à l’échelle de l’organisme. Le premier axe de la thèse a été dédié à l’analyse phylogénétique des ERD6-like par une approche de génomique évolutive. L’identification de 519 ERD6-like dans les protéomes de 47 Embryophytes a permis de reconstituer l’histoire évolutive de cette famille en mettant en exergue des événements majeurs de duplications. Le second axe a permis d’établir la cartographie de l’expression des ERD6-like dans les différents organes d’Arabidopsis thaliana et a mené à l’identification de gènes exprimés de façon constitutive dans tous les organes, et d’autres, manifestant une expression préférentielle. Le troisième axe a permis d’étudier la réponse des ERD6-like à la carence en eau, dans les feuilles d’A. thaliana. Pour cela, le phénotypage morphologique, biochimique et physiologique des rosettes de plantes cultivées en conditions normales d’alimentation hydrique ou de stress hydrique a été réalisé. Le profil d’expression des AtERD6-like au cours de la cinétique de carence en eau a mis en évidence l’induction de quatre AtERD6-like en réponse au déficit hydrique. L’analyse de simples mutants pour ces gènes, a permis d’initier l’étude de la diversification fonctionnelle des ERD6-like d’A. thaliana.