UPThèses

L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle des transporteurs de saccharose dans les racines d’A. thaliana pour mieux comprendre la répartition du carbone dans la plante entière. Nous nous sommes focalisés sur l’étude des deux principaux transporteurs de saccharose exprimés dans les racines : AtSUC1 et AtSUC2. Une étude du mutant KO suc1 et une étude des plantes greffées présentant la mutation KO du gène AtSUC2 uniquement dans les racines ont été réalisées sur des plantes au stade adulte (30 à 32 jours après semis) cultivées en rhizobox. De plus, les localisations de l’expression des gènes et des protéines de ces transporteurs ont été réalisées dans les racines de plantes adultes pour la première fois. La localisation de l’expression d’AtSCU1 dans les pointes racinaires, nous a permis de conclure sur un rôle potentiel d’AtSUC1 dans le déchargement du saccharose du phloème dans les zones de croissance des racines et/ou un rôle potentiel de senseur du signal glucidique ou du déficit hydrique, probablement en lien avec l’ABA. Les résultats montrent qu’AtSUC2 aurait un rôle dans le développement racinaire, certainement via le déchargement du saccharose du phloème dans les zones d’élongation des racines et dans le rechargement du phloème le long des racines (notamment dans les départs de racines latérales). De plus, AtSUC2 pourrait avoir un rôle dans l’augmentation locale d’hexoses liée à l’émergence des racines latérales. Enfin, nos résultats indiquent une contradiction entre la localisation de l’expression du gène AtSUC2 retrouvée dans le parenchyme cortical et la localisation de la protéine qui n’est pas retrouvée dans ces cellules. Néanmoins les deux approches s’accordent sur la localisation dans les cellules compagnes.

Le vieillissement est un processus physiologique au cours duquel l’ensemble de l’organisme voit son fonctionnement modifié. Il s’agit d’un remodelage génotypique et phénotypique, en lien avec le stress oxydatif. Les molécules antioxydantes comme les composés phénoliques (CP) ont pris une place importante dans la diète humaine, à titre de compléments alimentaires et/ou à titre thérapeutique. Toutefois, les conséquences d’un usage à long terme de ces molécules visant à reverser les effets du vieillissement sur les fonctions organiques, restent encore mal élucidées. Dans ce contexte, et compte tenu de notre intérêt pour le cœur, le rein et le microbiote intestinal, l’objectif de cette thèse est d’évaluer, sur de jeunes rats mâles, les effets des CP administrés à différentes concentrations, pendant quatorze mois. Les groupes traités par les CP ont montré une préservation, avec l’âge, de la performance cardiaque par rapport aux témoins non traités. De plus, les myocardes de rats âgés traités ont présenté de moindres signes d’inflammation, de fibrose et d’apoptose que les témoins. Ces modifications sont soutenues par un remodelage du niveau d’expression protéique des marqueurs de l’hypertrophie et du stress oxydatif, et des résultats préliminaires suggèrent une activation du courant potassique KATP en présence des CP sur les myofibroblastes. Le tissu rénal conserve son architecture normale avec l’âge chez tous les groupes. Enfin, les métabolites issus des CP ont montré une modulation sélective du microbiote intestinal vers un phénotype sain. Nos travaux montrent dans un modèle murin qu’une consommation régulière de CP permet de préserver le cœur, les reins et le microbiote du remodelage lié au vieillissement.

Les maladies du bois de la vigne, causées par des champignons nécrotrophes, ont un impact considérable sur l'économie viticole au niveau mondial. En effet, tous les cépages Vitis vinifera cultivés actuellement présentent une sensibilité plus ou moins forte à ces champignons. Dans le but d'établir un test rapide d'évaluation de la sensibilité de clones de vigne (nouvellement sélectionnés ou futures obtentions variétales) à Eutypa lata, le champignon responsable de l'Eutypiose, une recherche de marqueurs moléculaires de tolérance a été réalisée. Suite à l'infection in vivo et in vitro d'une douzaine de cépages de sensibilité différente par E. lata, plusieurs gènes candidats ont été identifiés comme marqueurs potentiels de la tolérance à la maladie à partir d'une étude transcriptomique. A l'aide d'un système innovant d'infection in vitro, le dialogue moléculaire sans contact physique entre des disques foliaires de V. vinifera et le mycélium d’E. lata a également été étudié chez les douze cépages. Cette étude a permis de mettre en évidence le rôle potentiel d'éliciteurs dans la mise en place des réponses de défenses. De plus, l'infection par E. lata régule différentiellement l'expression des gènes codant pour un transporteur d'hexoses et des invertases, ainsi que les activités invertasiques associées, chez les cépages de sensibilités variables. Les travaux de recherche présentées dans cette thèse ont ainsi permis l'identification des marqueurs de tolérance à l'Eutypiose et la mise au point d'un test d'infection in vitro efficace et fiable, permettant de diagnostiquer la sensibilité des futures créations variétales. De plus les résultats obtenus démontrent l'importance des éliciteurs dans la mise en place des défenses, de la régulation du transport et du métabolisme des sucres au cours de l'infection par E. lata.

L'objectif de cette thèse était de développer et de caractériser un modèle de cellules souches cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire. Après avoir sélectionné et caractérisé une population de cellules souches d'origine mésenchymateuse, isolée à partir d'auricules humaines, exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d'immuno-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1. la caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs de la signalisation calcique et 2. l'étude de leur différenciation in vitro en parallèle à l'activité calcique intracellulaire. Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker. Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, Kv, NCX, s'expriment durant la différenciation. L'enregistrement de l'activité calcique (via une sonde optogénétique) montre la présence d'oscillations calciques qui évoluent en fréquence et en intensité pendant la différenciation. Les stocks-IP3 sensibles et l'échangeur NCX joueraient un rôle fondamental. Nous avons ensuite étudié l'importance du canal BKCa et des récepteurs sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+. L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-renouvellement mais n'affecte pas la migration. Quant à la S1P elle freine la prolifération et l'auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3. Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque.

De nombreuses maladies génétiques sont directement liées à la reconnaissance de protéines mal repliées par le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur rétrotranslocation vers le cytosol puis leur dégradation. Dans le cas des glycoprotéines mutées, comme la protéine F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la démannosylation extensive de leur résidus mannoses constitue une étape clé dans ce processus. L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des molécules capables de rétablir l’expression membranaire de F508del-CFTR en ciblant cette activité enzymatique. Dans un premier temps, nous avons testé des dérivés multivalents basés sur le Deoxymannojirimycin (DMJ), un inhibiteur spécifique de la classe I des α-mannosidases et révélé leur effet correcteur puissant sur F508del-CFTR. Nous avons par la suite mis en évidence leur mécanisme d’action et tenté d’expliquer l’augmentation d’efficacité observée entre les monovalents et les multivalents. Nous nous sommes enfin focalisés sur le rôle des principales mannosidases dans le RE, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) et la famille des lectines EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein). Nous avons montré par une stratégie de siRNA qu’ERManI, EDEM1 et EDEM2 sont impliquées dans la rétention réticulaire du F508del-CFTR. Notre étude ouvre ainsi de nouvelles perspectives quant à l’identification de nouveaux agents pharmacologiques ciblant ces protéines.

Le but de notre travail est de développer une stratégie de vectorisation pour conférer la mobilité phloémienne aux produits agrochimiques en appliquant le concept de prodrogue dans l'élaboration de composés phytopharmaceutiques. Le fenpiclonil, fongicide non systémique de la famille des phénylpyrroles, a été choisi comme composé parent modèle et modifié en l'associant à un acide alpha-aminé ou à un monosaccharide. La mobilité phloémienne des conjugués entre le fenpiclonil et les acides L ou D-glutamique ou le D-glucose (D-GFC) a été évaluée chez des plantules de ricin. Le test de systémie a montré que le L-aminoacide était nettement plus favorable à la mobilité phloémienne que l'acide D-aminé ou le D-glucose. Les résultats suggèrent que le conjugué fenpiclonil/L-aminoacide est reconnu et manipulé par un système de transport d'acide aminé stéréospécifique énergisé par la force proton-motrice. Des expériences complémentaires ont montré que le D-GFC était un inhibiteur puissant et sélectif de l'absorption du saccharose par les tissus foliaires et du chargement phloémien du saccharose. En raison de l'inhibition spécifique des transporteurs de saccharose (par exemple AtSUC2), le D-GFC peut être envisagé comme un nouvel outil en phloémologie. Enfin, nous avons exploré l'impact de la modification de structure de l'espaceur afin d'optimiser la stratégie de prodrogue. Après avoir introduit différentes structures d'espaceur entre le fenpiclonil et la fonction acide aminé, le conjugué qui contient un cycle triazole avec l'acide aminé comprenant la chaine la plus courte a montré la meilleure mobilité phloémienne et, par ailleurs, une systémie optimisée par rapport aux dérivés acides du fenpiclonil dans la gamme des valeurs de pH de l'apoplasme foliaire.

L’objectif de cette thèse était d’étudier les transporteurs de saccharose impliqués dans le développement des organes puits, et plus précisément leur rôle dans la racine des plantes soumises à la contrainte hydrique. L’expression des transporteurs AtSUCs et AtSWEETs a été cartographiée, au cours du développement complet de plantes A. thaliana cultivées en hydroponie, dans la rosette, la hampe, les siliques et les racines. En parallèle, nous avons évalué l’allocation du carbone et le métabolisme des sucres dans la plante entière au cours du développement pour finalement (1) avoir un aperçu de l’allocation du carbone, du métabolisme des sucres ainsi que de l’expression des transporteurs de saccharose et (2) discuter leurs possibles relations. Dans un second temps, nous avons conçu un système de culture en sol innovant appelé « Rhizobox » permettant la récolte de racines propres, l’analyse de l’architecture du système racinaire et l’application de la contrainte hydrique. Lors de la contrainte hydrique, la croissance racinaire est réduite, mais l’exploration en profondeur du système racinaire est maintenue probablement pour améliorer l’absorption d’eau. De plus, même si la rosette soumise à la contrainte hydrique était plus petite, l’export de 14C, vers la racine, était augmenté. Dans le même temps, les niveaux de transcrits des gènes de facilitateurs de saccharose AtSWEET11 et AtSWEET12 ainsi que du gène AtSUC2, un symporteur saccharose:H+ spécifique de la cellule compagne, tous trois impliqués dans le chargement du saccharose dans le phloème, étaient augmentés dans les feuilles des plantes soumises à la contrainte hydrique, corroborant l’augmentation de l’export du carbone vers la racine. De façon intéressante, les niveaux de transcrits des gènes AtSUC2 et d’ASWEET11-15, étaient plus élevés dans les racines stressées, soulignant (1) la potentielle existence d’un déchargement apoplastique du saccharose dans la racine d’A. thaliana et (2) un rôle putatif pour ces transporteurs de saccharose dans le déchargement du saccharose dans la racine étant donné qu’ils sont principalement exprimés dans les zones de la racine où la demande en carbone est importante.

Depuis plusieurs décennies, la communication intercellulaire par jonctions gap (CIJG) est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse. Cette implication semble complexe par le fait que les connexines pourraient augmenter la capacité d’invasion des cellules cancéreuses tout en diminuant leur prolifération. Ceci était particulièrement observé pour la connexine 43 (Cx43) dans le cas de cellules de gliomes. Or, les propriétés d’invasion des gliomes de haut grade, les glioblastomes multiformes (GBM), les rendent difficiles à supprimer par résection chirurgicale et favorisent leur récidive.
Afin de préciser le rôle de la Cx43 dans le contrôle des capacités invasives de cellules de GBM, nous avons utilisé une lignée de cellules de glioblastome humaine U251 exprimant par shRNA des niveaux, en ARNm et protéiques, de Cx43 réduits. Ces clones shRNA des cellules U251 montrent une corrélation entre le niveau d’expression de la Cx43 et le processus d’invasion. Au cours de ce travail, nous avons montré, pour la première fois, que la Cx43 est localisée dans les structures protéolytiques permettant l’invasion, les invadopodes. Nous avons démontré aussi que, par sa localisation, la Cx43 favorise la formation des invadopodes en agissant comme une protéine d’échafaudage qui permet l’interaction de Src de la Cortactine. De plus, l’activité hémicanal de la Cx43, probablement inhibée par le Bisphénol A, possède des effets négatifs sur la cinétique de développement des invadopodes. Une étude du protéome et du sécrétome des cellules U251 et des clones shRNA a permis l’identification des protéines impliquées dans l’invasion et la formation et fonction des invadopodes.
En conclusion, la Cx43 participe au processus invasif des cellules de GBM en favorisant la formation et la fonction des invadopodes. Cette nouvelle fonction de la Cx43 semble être la conséquence de ses propriétés de protéines d’échafaudage et hémicanal, et non de son rôle principalement décrit dans la CIJG.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, protéine sous membranaire indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Cette déficience augmenterait les influx cationiques par des microruptures de la membrane ou par la dérégulation de canaux tels que les canaux activés par l'étirement (SACs: Stretch-activated channel). Dans ce travail, les effets d'une stimulation mécanique ont été explorés sur des cardiomyocytes dans le contexte pathologique de la cardiomyopathie dilatée associée à la DMD. L'utilisation de fibres de carbone a permis de réaliser un étirement axial similaire aux conditions physiologiques de remplissage ventriculaire. Dans ces conditions, l'exploration de la topographie membranaire par la microscopie de conductance ionique à balayage n'a montré aucune évolution de la surface ni de lésion du sarcolemmel dans les conditions d'étirement. L'étude s'est donc focalisée sur l'activité de candidats moléculaires des SACs et plus particulièrement ceux appartenant à la famille des TRPs (Transient Receptor Potential) dans le dérèglement de l'homéostasie calcique induite par l'étirement. Les influx cationiques évalués par la technique d'extinction de fluorescence et l'étude de la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i) grâce à la sonde Fluo8 montrent une implication des canaux TRPV2 et TRPCs. Les premiers semblent responsables d'une entrée cationique et d'une augmentation de [Ca2+]i importante dans les cardiomyocytes mdx. Les seconds, bien que responsables d'un influx, ne participeraient pas à l'augmentation de [Ca2+]i. Ces résultats révèlent que les canaux TRPV2 pourraient jouer un rôle important dans la dérégulation calcique observée dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine.

Les sucres, sont des signaux métaboliques, impliqués dans le développement des plantes et leurs réponses aux contraintes du milieu. Les transporteurs de sucres se révèlent à la fois acteurs de la répartition des sucres et cibles de leur signalisation. L'ASR (ABA, Stress and Ripening) de la Vigne, VvMSA, étant identifiée comme protéine régulatrice de l'expression génique du transporteur d’hexoses VvHT1, l'objectif de la thèse est d'appréhender ses rôles physiologiques dans une démarche de biologie intégrée. Le premier axe a été dédié à la mise en place des modèles biologiques, des cellules embryogènes et non embryogènes de Vigne, issues du même fond génétique mais cultivées sur deux sources de carbone différentes. La caractérisation des cinétiques de prolifération et l'analyse des métabolomes ont mis en évidence leur sensibilité/tolérance différentielle à la carence en sucres. Le deuxième axe a porté sur la régulation de VvHT1 dans les deux types cellulaires sauvages et leurs mutants de surexpression/répression de VvMSA. L'approche pharmacologique utilisant des analogues du glucose, l'analyse de l'expression génique, le transport du glucose et l'activité des enzymes de la glycolyse indiquent que VvMSA affecte l'expression de VvHT1 par la voie dépendante du métabolisme du glucose. Le troisième volet a été réalisé par une approche de protéomique quantitative et comparative des protéines nucléaires des cellules embryogènes sauvages et réprimées pour VvMSA. Les protéines à expression significativement affectée par l'absence de l'ASR, laissent entrevoir un nouveau rôle à l'interconnexion des réponses métaboliques aux stress et la régulation épigénétique de l'expression génique.