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Développement d'une approche analytique non ciblée pour l'étude des protéines dans les milieux complexes, environnementaux et biologiques

Grâce aux récents progrès en terme d'instrumentation analytique, la protéomique, en tant que science qui étudie le protéome d'un organisme ou d'un milieu, a connu un véritable tournant et a permis d'étendre le champ des connaissances sur le fonctionnement du vivant dans son ensemble (structure, fonction, métabolisme, dynamisme). Néanmoins, l'étude des protéomes représente un challenge pour de nombreux biologistes, chimistes et biochimistes, en raison notamment de la complexité des échantillons étudiés. De nombreux protocoles analytiques ont d'ores et déjà été développés. Cependant, dans leur ensemble, ces stratégies sont relativement longues et multi-étapes et le plus souvent ciblées sur une protéine donnée. Dans ce contexte, ce travail de thèse a pour objectif de simplifier les protocoles expérimentaux existants afin de limiter les pertes en protéines et ainsi amplifier leurs signaux au cours d'une analyse « Bottom-up » par LC-HRMS (analyse « hors gel »). Chaque étape du processus a été décortiquée et optimisée. Dans un premier temps, les paramètres UPLC-HRMS/MS ont été optimisés afin d'améliorer la détection et la quantification des protéines présentes à des concentrations très variables dans les milieux étudiés. Ensuite, une approche de purification simplifiée qui repose sur une seule et unique étape de lavage et solubilisation des protéines a été mise au point. La démonstration de son efficacité « chimique » et « biologique » a ensuite été réalisée via une étude mécanistique au cours de laquelle les changements de conformation des protéines ont été étudiés à chacune des étapes de purification proposées. Enfin, certains paramètres influençant l'extraction des protéines à partir de ces mêmes matrices ont été étudiés afin de proposer à terme un protocole d'extraction à la carte compatible avec une analyse directe par LC-HRMS/MS.

Mots-clés libres : Protéines, analyse « Bottom up », LC-HRMS/MS, purification, extraction, étude mécanistique.

Rameau (langage normalisé) :
• Protéines
  
• Marqueurs biologiques
  
• Protéomique
  
• Chromatographie en phase liquide
  
• Spectroscopie