UPThèses

Afin de conserver la qualité architecturale du rosier miniature sans l'utilisation de régulateurs de croissance, l'application d'une contrainte hydrique a été substituée au paclobutrazole. La caractérisation de l'état de stress hydrique des rosiers a été réalisée par la mesure du potentiel hydrique et de la transpiration relative. Les effets morphologiques se traduisent par la réduction de la taille et l'augmentation du nombre de ramifications. Les études histologiques ont révèlé un accroissement significatif de l'aire du xylème. Ces impacts de la carence en eau sur la charpente des rosiers miniatures sont corrélés à l'accumulation du saccharose et du fructose dans la sève xylémienne. Le choix de gènes potentiellement impliqués dans la réponse du rosier au déficit hydrique a été effectué avec a priori en visant le transport et le métabolisme des sucres, des gènes du contrôle de la ramification et des marqueurs du stress hydrique. Des sondes spécifiques d'une vingtaine de gènes ont été clonées grâce à la base des EST de rosier existant ou par PCR avec des amorces dégénérées. Les gènes sélectionnés pour la modification de leur expression par macroarrays ont été confirmés par Northern blot et/ou RT-qPCR. Plusieurs gènes ont répondu face au stress hydrique imposé comme RhPGlcT1-2, RhSuSy et RhMAX1-2-3. La validation des gènes choisis requiert le développement de protocoles de transformation génétique du rosier. Deux protocoles de transformation via A. tumefaciens ont été mis en place. Le premier utilise une suspension cellulaire non embryogène et vise une régénération directe. Le deuxième, basé sur l'embryogenèse somatique, a atteint une efficacité de transformation de 25%.

La répartition des sucres requiert l'activité de transporteurs membranaires et représente une étape cruciale dans la réponse de la plante au déficit hydrique. Les séquences de 63 transporteurs de sucres ont été identifiées chez la Vigne. L'analyse in silico a identifié 7 sous familles de tranporteurs de monosaccharides et plusieurs élements cis de régulation dans les promoteurs. L'analyse d'expression par macroarray a permis d'identifier 4 gènes de transporteurs fortement exprimés dans tous les organes végétatifs (VvHT1, VvHT3, VvPMT5, VvSUC27), d'autres préférentiellement exprimés dans les feuilles matures (VvHT5), les racines (VvHT2) et les pépins (VvHT3, VvHT5) et 3 régulés au cours du développement de la baie (VvHT2, VvTMT1, VvTMT2). L'analyse par macroarray révèle que l'expression de VvHT5, VvSUC11, VvGIN2 et VvMSA est induite dans les feuilles matures, en réponse au déficit hydrique alors que l'expression de VvHT1 est inhibée. La carence en eau déclenche l'accumulation de glucose, fructose et saccharose dans les feuilles matures de Vigne. Le gène VvMSA a été surexprimé ou réprimé dans des cellules embryogènes de Vigne génétiquement modifiées. La répression de VvMSA diminue l'activité d'absorption du glucose et l'expression de VvHT1. Le phénotype des vitroplants régénérés ainsi que l'expression de VvHT1 et VvMSA ont été étudiés en condition in vitro et ex vitro. Les résultats obtenus suggèrent la présence d'une voie de régulation de l'expression du gène VvHT5 par le fructose. Un modèle de la signalisation glucidique dans l'expression du gène VvHT1 est proposé, comprenant une voie de régulation par les disaccharides et deux par le glucose, un VvMSA-dépendant et un VvMSA-indépendant.

Les sucres, sont des signaux métaboliques, impliqués dans le développement des plantes et leurs réponses aux contraintes du milieu. Les transporteurs de sucres se révèlent à la fois acteurs de la répartition des sucres et cibles de leur signalisation. L'ASR (ABA, Stress and Ripening) de la Vigne, VvMSA, étant identifiée comme protéine régulatrice de l'expression génique du transporteur d’hexoses VvHT1, l'objectif de la thèse est d'appréhender ses rôles physiologiques dans une démarche de biologie intégrée. Le premier axe a été dédié à la mise en place des modèles biologiques, des cellules embryogènes et non embryogènes de Vigne, issues du même fond génétique mais cultivées sur deux sources de carbone différentes. La caractérisation des cinétiques de prolifération et l'analyse des métabolomes ont mis en évidence leur sensibilité/tolérance différentielle à la carence en sucres. Le deuxième axe a porté sur la régulation de VvHT1 dans les deux types cellulaires sauvages et leurs mutants de surexpression/répression de VvMSA. L'approche pharmacologique utilisant des analogues du glucose, l'analyse de l'expression génique, le transport du glucose et l'activité des enzymes de la glycolyse indiquent que VvMSA affecte l'expression de VvHT1 par la voie dépendante du métabolisme du glucose. Le troisième volet a été réalisé par une approche de protéomique quantitative et comparative des protéines nucléaires des cellules embryogènes sauvages et réprimées pour VvMSA. Les protéines à expression significativement affectée par l'absence de l'ASR, laissent entrevoir un nouveau rôle à l'interconnexion des réponses métaboliques aux stress et la régulation épigénétique de l'expression génique.