UPThèses

L’absence de règlementation et de traitements adaptés en stations d'épuration des eaux usées (STEP) conduit aux rejets de nombreux produits pharmaceutiques dans l'environnement. Les antibiotiques sont désormais largement retrouvés dans les milieux aquatiques à travers le monde, ce qui en fait des contaminants émergents très préoccupants. Outre leurs effets toxiques, c’est le possible développement de bactéries antibiorésistantes qui suscite l’attention. En 2014, on estimait déjà que 700 000 personnes mouraient chaque année à cause d'agents pathogènes résistants. Malgré leurs faibles concentrations, l'exposition constante des microorganismes à ces composés semble conduire au développement/maintien de la résistance aux antimicrobiens (RAM). De nombreux marqueurs de la résistance aux antibiotiques (éléments génétiques mobiles, bactéries résistantes, gènes, etc.) sont retrouvés dans les écosystèmes d'eau douce. Ainsi, les bactéries d'origine hydrique, qui vivent naturellement dans des communautés structurées appelées biofilms, sont devenues un réservoir potentiel de gènes de résistance aux antibiotiques. L'objectif de ce travail était d'étudier l'évolution temporelle des concentrations d'antibiotiques et des gènes de résistance aux antibiotiques dans les communautés microbiennes des rivières. Des expériences de terrain ont été réalisées sur deux rivières françaises : le Clain (en amont et en aval de la STEP) et la Vienne (en amont de la STEP). La relation entre les concentrations d'antibiotiques, la composition taxonomique et l'occurrence des gènes de résistance aux antibiotiques dans les communautés de biofilms exposées à une contamination par antibiotiques a été analysée et l'influence d'autres paramètres, tels que les variations saisonnières, les paramètres hydroclimatiques et la prescription d'antibiotiques a également été évaluée. Les résultats montrent que dix-huit à vingt composés ont été détectés dans les biofilms, collectés dans les deux rivières. La comparaison des concentrations mesurées dans les biofilms avec les concentrations prédites sans effets (PNECENV et PNECMIC), montre que la quantité d’antibiotique peut inhiber la croissance bactérienne et contribuer au maintien et à l'enrichissement des souches résistantes ainsi qu'à la sélection de nouveaux mutants résistants. En outre, les résultats ont montré que les biofilms collectés en aval de la STEP présentaient une quantité d'antibiotiques et un nombre de gènes de résistance significativement plus élevés que ceux collectés en amont. Cependant, l'analyse statistique n'a pas confirmé une corrélation entre la présence d'antibiotiques (et leurs concentrations) et l'émergence de gènes de résistance aux antibiotiques. L'absence d'un effet direct des antibiotiques sur la sélection des gènes de résistance suggère que l'émergence de la RAM n'est probablement pas seulement due à la présence d'antibiotiques mais qu'il s'agit d'un processus plus complexe impliquant l'effet cumulatif de l'interaction entre les communautés bactériennes (biotiques) et la matrice abiotique. Bien que de nombreuses recherches aient été menées sur ce sujet, de nombreuses questions assez fondamentales sur l'écologie et les facteurs de la RAM dans l'environnement sont encore sans réponse. Par conséquent, des études plus approfondies sur la métagénomique et la communication inter-espèces ainsi que sur l'occurrence et l'expression des gènes de résistance aux antibiotiques à l'aide de l'analyse du métatranscriptome sont nécessaires pour identifier les principaux moteurs du maintien de la RAM dans l'environnement. Cette étude souligne que les STEP constituent un réservoir important de divers gènes de résistance aux antibiotiques. Des efforts supplémentaires et une législation prévoyant des limites de concentration clairement définies pour les antibiotiques et les déterminants de la résistance dans les effluents des STEP sont nécessaires pour prévenir leur propagation et leur persistance dans l'environnement.

La recherche de signatures chimiques pouvant révéler la présence de vie passée ou présente est l’un des objectifs majeurs des missions spatiales à visée exobiologique. A ce jour, les instruments dédiés à l’analyse in situ des composés organiques sont essentiellement des chromatographes en phase gazeuse. Des analyses réalisées par chromatographie en phase liquide pourraient permettre d’élargir la gamme de composés détectés. Le travail ici présenté a pour objectif de mettre en place une nouvelle stratégie analytique fondée sur le développement d’une maquette de chromatographie en phase liquide afin d’identifier des molécules complexes tels que des peptides. Ce travail se divise en trois parties incluant l’optimisation des conditions de séparation en laboratoire, puis la transposition de ces conditions sur une maquette dédiée à l’analyse in situ, et enfin une évaluation de sa résistance aux contraintes spatiales (vieillissement, cycle de température et irradiation). Après validation sur des analogues cométaires, une maquette assurant l’analyse d’une large gamme de composés, allant des oligopeptides aux monomères constitutifs (acides aminés), a été proposée avec des performances équivalentes à celles d’une chaine de chromatographie de laboratoire.

L'objet de ce travail a consisté en un suivi à la fois spatial et temporel de l'évolution des constituants organiques d'un compost de déchets verts et bio-déchets épandu sur un sol sous prairie. Trois quantités de compost ont été apportées sur le sol : 50, 100 et 150 t/ha. L'évolution de la matière organique des sols amendés a été étudiée après divers fractionnements chimiques et physiques. La dynamique spatiale de cette MO a été appréhendée par l'analyse de marqueurs moléculaires lipidiques contenus dans la matière organique dissoute. Les différents échantillons de sol ont été analysés de manière globale par analyse élémentaire, ATD-ATG et IRTF. Ces analyses ont mis en évidence une augmentation de la quantité de MO après apport de compost, mais également une meilleure conservation des lipides et des sucres lors d'épandages successifs des plus faibles doses. Cet apport de composés bio-disponibles favorise une augmentation de l'activité biologique dans le sol. Il en résulte un accroissement de la stabilité structurale du sol dès un an, probablement dû à l'agrégation des particules organo-minérales fines. D'autres différences lors de l'incorporation de la matière organique déchet ont été mises en évidence par l'étude des échantillons en thermochimiolyse (en présence de TMAH). En effet, les fractions granulométriques ont montré une incorporation préférentielle des composés issus du bois, après 7 mois, et des graminées après 13 mois. En ce qui concerne les substances humiques, le phénomène opposé a été observé dans les acides humiques et l'humine, alors que les acides fulviques ont montré essentiellement une MO dérivant des graminées.

Grâce aux récents progrès en terme d'instrumentation analytique, la protéomique, en tant que science qui étudie le protéome d'un organisme ou d'un milieu, a connu un véritable tournant et a permis d'étendre le champ des connaissances sur le fonctionnement du vivant dans son ensemble (structure, fonction, métabolisme, dynamisme). Néanmoins, l'étude des protéomes représente un challenge pour de nombreux biologistes, chimistes et biochimistes, en raison notamment de la complexité des échantillons étudiés. De nombreux protocoles analytiques ont d'ores et déjà été développés. Cependant, dans leur ensemble, ces stratégies sont relativement longues et multi-étapes et le plus souvent ciblées sur une protéine donnée. Dans ce contexte, ce travail de thèse a pour objectif de simplifier les protocoles expérimentaux existants afin de limiter les pertes en protéines et ainsi amplifier leurs signaux au cours d'une analyse « Bottom-up » par LC-HRMS (analyse « hors gel »). Chaque étape du processus a été décortiquée et optimisée. Dans un premier temps, les paramètres UPLC-HRMS/MS ont été optimisés afin d'améliorer la détection et la quantification des protéines présentes à des concentrations très variables dans les milieux étudiés. Ensuite, une approche de purification simplifiée qui repose sur une seule et unique étape de lavage et solubilisation des protéines a été mise au point. La démonstration de son efficacité « chimique » et « biologique » a ensuite été réalisée via une étude mécanistique au cours de laquelle les changements de conformation des protéines ont été étudiés à chacune des étapes de purification proposées. Enfin, certains paramètres influençant l'extraction des protéines à partir de ces mêmes matrices ont été étudiés afin de proposer à terme un protocole d'extraction à la carte compatible avec une analyse directe par LC-HRMS/MS.

Le taux de matière organique (MO) d'un sol influence ses propriétés physico-chimiques et son activité biologique. La dynamique de cette MO, particulaire ou dissoute, influence également la concentration de CO2 atmosphérique et joue ainsi un rôle sur les changements climatiques. Une des réponses à la diminution du stock de carbone dans les sols est l'apport de matière organique exogène. Le carbone organique dissous, intervenant dans les principaux mécanismes de préservation et/ou dégradation de la matière organique du sol (MOS), n'est cependant que peu pris en compte lors de l'étude de ces apports exogènes. Le principal objectif de cette étude est de mieux caractériser les MOD présentes dans les horizons de surface d'un sol. Les eaux collectées par bougies poreuses sur quatre profondeurs (15 à 100 cm) proviennent de parcelles amendées en 2006 (150 t/ha de compost de déchets verts et bio-déchets) et de parcelles témoins sous prairie. Les eaux ont été caractérisées par l'intermédiaire des techniques analytiques globales et moléculaires (spectrofluorimétrie, chromatographie d'exclusion de taille, thermochimiolyse, CG/SM). Les résultats de cette étude ont mis en évidence pour les deux types de parcelles une variabilité de la MOD (taille et polarité) suivant la profondeur et la saison. Le suivi de la MOS/MOD, et plus particulièrement des composés lipidiques, a permis de confirmer la séquestration du carbone organique exogène. La caractérisation de la MOD s'avère ainsi être un indicateur de la qualité des sols.