UPThèses

Il existe une composante inflammatoire dans la maladie d’Alzheimer (MA), dont le lien avec le déclin cognitif n’est pas scientifiquement démontré. Dans une cohorte de patients MA (MMSE entre 16 et 25), nous avons analysé la relation longitudinale entre les médiateurs de l’inflammation et le statut cognitif. L’objectif principal était d’évaluer la valeur pronostique des taux plasmatiques d’IL 1β, IL-6, TNFα et RANTES sur le déclin cognitif à deux ans dans une étude multicentrique. Nos objectifs secondaires étaient de rechercher un lien entre ces marqueurs, et le statut cognitif au diagnostic, et après six mois et un an de suivi. Nous avons également recherché la valeur pronostique de la protéine kinase PKR sur le déclin cognitif dans une étude ancillaire monocentrique. Au final, 109 patients ont été inclus et 72 patients (âge moyen: 79,4 ± 6,8 ans, score MMSE moyen: 21,2 ± 2,7) ont été évalués à deux ans. Aucune corrélation entre les concentrations plasmatiques des marqueurs inflammatoires et le statut cognitif au diagnostic et après deux ans d’évolution n’a été retrouvée. De plus, il n’a pas non plus été mis en évidence de corrélation entre ces marqueurs inflammatoires plasmatiques ou dans les cellules mononucléées sanguines (PBMCS) et le statut cognitif. En revanche, l’étude impliquant PKR a mis en évidence des corrélations entre les taux de PKR et son activation avec le déclin cognitif. Nos résultats n’ont pas montré de lien entre les marqueurs inflammatoires étudiés et la cognition au cours de la MA. Cependant, nous avons montré un lien entre l’activation de PKR dans les PBMCs et le déclin cognitif au cours de la MA à un stade débutant. Ces résultats nécessitent d’être confirmés sur un plus grand nombre de patient avant de pouvoir transposer son utilisation en pratique clinique.

Le syndrome CHARGE (CS) est une maladie génétique rare caractérisée par de nombreuses anomalies congénitales, majoritairement causées par des altérations de novo du gène CHD7. Celui-ci code pour une protéine à chromodomaines, impliquée dans le remodelage ATP-dépendant de la chromatine. La grande majorité des altérations de CHD7 consiste en allèles nuls tels que des délétions, des substitutions non-sens ou des décalages du cadre de lecture. Nous avons réalisé le premier diagnostic moléculaire d’un patient Indonésien atteint du CS, en étudiant un panel de gènes (CHD7, EFTUD2, et HOXA1) par NGS (next-generation sequencing). Nous avons identifié une nouvelle mutation non-sens hétérozygote dans l’exon 34 du gène CHD7 (c.7234G>T ou p.Glu2412Ter). Par ailleurs, il n'existe pas d’analyse fonctionnelle qui permettrait de caractériser la pathogénicité des variants de la protéine CHD7 rencontrés chez des patients. C’est pourquoi l’objectif de ce travail est de mettre au point un test fonctionnel de la protéine CHD7, sous forme sauvage ou mutée. Pour cela, nous avons généré par mutagénèse dirigée des vecteurs codant pour trois variants faux-sens de CHD7 et le variant présentant une insertion de cinq acides aminés. Ensuite, les protéines CHD7, sous forme sauvage ou variante, ont été surexprimées dans la lignée HeLa. L’expression des protéines a été mise en évidence par western blot et par immunofluorescence. Pour étudier la fonctionnalité de CHD7, nous avons quantifié par RT-qPCR les transcrits de cinq gènes (l’ADNr 45S, SOX4, SOX10, MYRF, et ID2), dont la transcription est selon le littérature régulée par CHD7. Nous avons observé que l’expression de CHD7 sauvage entraînait une diminution significative et reproductible des quantités de transcrits correspondant à tous les gènes rapporteurs. Par contre, l’expression des quatre allèles variants de CHD7 n’avait aucun impact, ce qui suggère que ces variants ne sont pas fonctionnels. Par ailleurs, nous avons appliqué notre test biologique dans des cellules de la lignée SH-SY5Y, pour lesquelles nous avons introduit une mutation faux-sens dans le génome en utilisant la technique CRISPR/Cas9. Lorsque ce variant était exprimé, les niveaux de transcription des cinq gènes rapporteurs n’étaient pas significativement différents de ceux observés dans les cellules où les deux allèles de CHD7 avaient été invalidés. Par conséquent, les variants étudiés peuvent être répertoriés comme résultant de mutations causales du CS.

La dermatite atopique (DA) est une maladie chronique inflammatoire de la peau qui se caractérise par une altération de la barrière cutanée, une dysfonction dans la réponse immunitaire et une dysbiose du microbiote cutanée associée à une forte colonisation par Staphylococcus aureus. De plus, les patients atteints de DA ont un risque de développer des infections virales, notamment l’eczéma herpétique (EH) causé par le virus herpes simplex (HSV). Cependant, la physiopathologie de l’EH ainsi que le rôle des facteurs de virulence de S. aureus sont peu connus et le lien entre infections virales et bactériennes est non déterminé. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés au rôle des toxines Phenol-Soluble Modulines (PSMs) de S. aureus en utilisant le PSMα3 synthétique et purifié et les sécrétomes de 3 souches de S. aureus, une qui exprime tous les PSMs, une délétée pour les PSMα et une délétée pour l’ensemble des PSMs. Nous avons ainsi mis en évidence, à la fois dans un modèle in vitro de kératinocytes primaires humains et ex vivo d’explants de peau, une induction de l’expression et de la production de médiateurs pro-inflammatoires par les PSMα à des concentrations non lytiques. En revanche, les PSMs de S. aureus ne semblent pas favoriser la réplication de l’HSV. D’autres part, nous étudions les interactions entre les cytokines pro-inflammatoires surexprimées dans la DA et les infections par HSV-1. Ainsi, nous avons mis en évidence, que dans un modèle 3D, trois combinaisons de cytokines surexprimées dans la DA favorisaient la réplication d’HSV-1 ce qui en fait donc des facteurs prédisposant à l’EH. Enfin, à ce jour, peu de traitements contre les infections par HSV existent et de nombreuses résistances à l’acyclovir, traitement le plus fréquent, apparaissent. Nous avons identifié deux cathélicidines, l’une issue du python birman (PB-Cath) et l’autre du rat taupe glabre (HG-Cath) comme de potentiels candidats puisqu’ils réduisent significativement la réplication d’HSV-1 dans des kératinocytes primaires humains.

La dermatite atopique (DA) aussi appelée eczéma est une dermatose inflammatoire chronique se manifestant par un prurit intense et une sécheresse cutanée. La DA est multifactorielle et est caractérisée par une perturbation de la fonction barrière, une dérégulation de la réponse inflammatoire avec une réponse de type 2 dominante, impliquant des cytokines particulières telles que l’interleukine (IL)-25, l’IL-33 et le Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP), un infiltrat lymphocytaire T cutané, ainsi qu’une dysbiose caractérisée par une colonisation par Staphylococcus aureus et S. epidermidis des lésions cutanées. Toutefois, le lien de cause à effets entre ces différents facteurs nécessite d’être mieux évalué afin d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de la DA. Ce travail de thèse a pour but d’étudier : (i) les effets de cytokines de type 2, l’IL-25, l’IL-33 et le TSLP, dans la réponse kératinocytaire, (ii) l’impact de la colonisation par S. aureus dans la réponse inflammatoire des lésions cutanées et (iii) le phénotype des lymphocytes T (LT) circulants de patients atteints de DA. Par des analyses transcriptionnelles sur des cultures primaires de kératinocytes humains, nous montrons que la modulation de l’expression de la cytokine pro-inflammatoire IL-36γ par l’IL-25, l’IL-33 et TSLP est dépendante de l’état de différenciation du kératinocyte. De plus, l’IL-33 est impliquée dans l’induction de l’expression du peptide antimicrobien hBD-2 par le kératinocyte. D’autre part, l’étude transcriptionnelle de peaux non lésionnelles et lésionnelles de DA permet de constater une augmentation de la colonisation par S. aureus et S. epidermidis dans les peaux lésionnelles. La quantification des facteurs de virulence produits par S. aureus montre une augmentation de l’expression des toxines phénol soluble modulines (PSM) α et PSMγ, suggérant l’implication de ces toxines, connues pour favoriser la réponse pro-inflammatoire des kératinocytes, dans la DA. Nos données mettent en évidence que les peaux lésionnelles colonisées par S. aureus sont associées à une inhibition de l’expression de gènes codant des protéines impliquées dans la différenciation épidermique (filaggrine, loricrine et GATA3), et dans la régulation de la réponse inflammatoire, par l’inhibition de l’IL-34, une cytokine immunomodulatrice. De plus, une augmentation de l’expression de l’IL-33 et de peptides antimicrobiens (hBD-2, S100A8, S100A12 et LL-37) est observée dans les peaux colonisées de DA en comparaison aux peaux non colonisées. Ces données montrent un lien entre la colonisation par S. aureus dans la perturbation de la barrière cutanée et la promotion d’une réponse pro-inflammatoire et d’une induction des peptides antimicrobiens dans la peau lésionnelle qui semble inefficace pour lutter contre la colonisation par S. aureus. Enfin, l’étude du phénotype des LT circulants de patients atteints de DA sévère ou colonisés par S. aureus présentent une augmentation de la fréquence des marqueurs d’activation ICOS et HLA-DR uniquement dans les populations CD4 et CD8 CCR4+. Le récepteur CCR4 est un marqueur d’homing retrouvé majoritairement exprimé par les LT dans la peau, suggérant un rôle spécifique des LT CCR4+ dans la DA. De plus, nous mettons en évidence une augmentation des LT helper 2 (LTh2) corrélée à une diminution de la fréquence des LTh1 et des LT régulateurs exprimant FOXP3+ en comparaison aux donneurs sains. L’ensemble de ce travail renforce le lien entre la colonisation par S. aureus, la perturbation de la fonction barrière et la dérégulation de la réponse inflammatoire chez les patients atteints de DA.

L’antibiorésistance est un phénomène décrit depuis la découverte des premiers antibiotiques. Cependant, leur utilisation déraisonnée, à la fois en santé humain et vétérinaire, a favorisé l’émergence et l’installation de mécanismes de résistance à de nombreuses classes d’antibiotiques, dont les bêta-lactamines. Cette classe constitue le traitement de référence des infections à bacilles Gram-négatifs, comme Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. De nouvelles bêta-lactamines, comme l’association ceftolozane/tazobactam, ceftazidime/avibactam ou encore le cefiderocol, ont été développées pour être efficace sur les bactéries multi-résistantes. L’émergence de mécanismes de résistance spécifiques à ces molécules a malheureusement été décrite lors de leur utilisation clinique. De plus, de nombreux outils de diagnostics, comme le séquençage du génome entier, permettent d’identifier le ou les mécanismes potentiellement responsables de la résistance. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’utiliser des approches complémentaire de microbiologie, incluant de la biologie moléculaire, à des méthodes de modélisation de données, afin de caractériser des mutations responsables de résistance aux nouvelles bêta-lactamines. Dans une première partie, un couple de P. aeruginosa, initialement sensible au ceftolozane/tazobactam, puis devenu résistant sous traitement par cette association, a été spécifiquement étudié. Les mutations probablement responsables de la résistance ont été identifiées par séquençage génome entier (AmpC:p.G183D et AmpD:p.H157Y), puis reproduites dans une souche de référence (PAO1). Les données expérimentales ont montré une décorrélation entre les mesures de concentration minimal inhibitrice (CMI) et les résultats de courbes de bactéricidie (TKC). La modélisation semi-mécanistique pharmacocinétique/pharmacodynamique a permis de décrire de façon précise l’impact de chaque mutation, en incluant la contribution dans la résistance acquise (effet immédiat) et la résistance adaptative. Les outils utilisés lors de cette première partie ont permis l’obtention de résultats sur la sensibilité à l’imipénème et au ceftazidime/avibactam. Ces données sont importantes pour comprendre l’effet de mutations individuelles et associées sur la sensibilité aux antibiotiques, notamment dans le cadre du développement des antibiogrammes in silico. Dans une seconde partie, la résistance au cefiderocol apparue dans des souches cliniques de K. pneumoniae a été investiguée grâce à la mise en place de méthodes de séquençage de troisième génération au sein du laboratoire. La description de tous les mécanismes de résistance déjà présents a pu être réalisée, et une nouvelle mutation dans le gène fiu, jamais identifiée dans une souche clinique, a pu être mise en évidence.