UPThèses

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s'exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l'hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l'incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l'hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Crerecombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de Wolbachia.

La symbiose constitue une force évolutive majeure permettant entre autre l'adaptation et la réponse des hôtes aux agents pathogènes. Chez le crustacé isopode Armadillidium vulgare, la présence de Wolbachia altère l'immunocompétence de son hôte en diminuant le taux d'hémocytes circulants (THC) et en augmentant la septicémie naturelle. La présence de Wolbachia dans les hémocytes et les organes hématopoïétiques a soulevé de nombreuses questions quant aux conséquences que cela entraîne sur le fonctionnement du système immunitaire et sur l'immunocompétence d'A. vulgare. Nous avons donc étudié l'impact de cette symbiose sur les hémocytes, l'immunocompétence et l'expression de gènes de l'immunité. Ainsi Wolbachia est présente dans plus d'un tiers des hémocytes et sa présence diminue la proportion d'hémocytes granulaires circulants chez les animaux âgés d'un an, sans affecter le THC à cet âge. L'activité phénoloxydase diminue avec l'âge et le statut symbiotique. En revanche, la présence de Wolbachia semble protéger les hémocytes de l'apoptose et augmenter l'immunocompétence d'A. vulgare lors d'une infection par Listeria ivanovii. Enfin, la quantification de l'expression des gènes de l'immunité a révélé une tendance à la sous-expression au niveau de l'animal entier et des ovaires mais à la sur-expression dans les tissus immunitaires. La présence de Wolbachia modifie donc les caractéristiques du système immunitaire aux niveaux cellulaire et humoral, ainsi que l'immunocompétence d'A. vulgare. L'étude de nouveaux paramètres permettra d'établir si la présence de Wolbachia constitue réellement un avantage pour son hôte ou si au contraire la bactérie présente un coût parasitaire...

La Sélection Assistée par Marqueurs (SAM) est un outil d'aide à la sélection largement étudié pour l'obtention des variétés lignées ou hybrides mais peu d'auteurs ont traité de l'obtention des variétés synthétiques. Ces dernières sont sélectionnées à partir de descendances de polycross qui sont en fait des populations biparentales connectées. L'objectif de cette thèse est de développer des méthodologies pour utiliser la SAM dans le schéma de sélection du ray-grass anglais en prenant comme exemples de caractères la hauteur de plante et la résistance à la rouille couronnée. Dans une première partie, à partir de trois populations biparentales connectées par un parent commun, l'analyse multipopulations connectées du logiciel MCQTL s'est révélée plus performante pour identifier des allèles favorables que la détection réalisée dans chacune des populations. Cette méthode a permis de détecter un grand nombre de QTL (Quantitative Trait Loci) malgré une base génétique étroite du matériel élite utilisé. Dans une deuxième partie, ce type d'analyse a permis de détecter des QTL directement à partir du matériel de sélection tout en mettant en évidence les contraintes liées à ce type de matériel. L'utilisation des QTL au sein des schémas de sélection pose la question de leur stabilité dans différents fonds génétiques. Ainsi dans une dernière partie, il a été montré que seuls les QTL ayant des effets forts sont stables. Ces résultats ont permis d'apporter des propositions d'implémentation de la SAM chez les espèces commercialisées sous forme de variétés synthétiques, en plaçant les phases de détection de QTL directement dans le schéma de sélection.

Les Wolbachia sont des alpha-proteobactéries présentes chez de nombreux arthropodes et nématodes filaires. Ces bactéries héritées maternellement induisent chez leurs hôtes des phénotypes allant du parasitisme au mutualisme, avec le long de ce continuum des phénotypes tels que la féminisation (F), l'incompatibilité cytoplasmique (IC) ou la mort des mâles. Wolbachia est ainsi un modèle particulièrement intéressant pour étudier les différents types de relations symbiotiques. Chez Brugia malayi, comme pour les autres nématodes filaires, Wolbachia vit en symbiose obligatoire avec son hôte. L'élimination de la bactérie par des traitements antibiotiques entraîne une perte de fertilité voire la mort du nématode. Chez l'isopode terrestre Armadillidium vulgare, Wolbachia induit la féminisation des mâles génétiques en femelles fonctionnelles entraînant des biais de sex-ratio vers les femelles dans la descendance. Pour comprendre les mécanismes impliqués dans ces deux symbioses, nous avons mis au point une nouvelle méthode de capture pour isoler l'ADN de Wolbachia et séquencer 8 souches de Wolbachia d'isopodes (F et IC). Une étude de génomique comparative a permis d'établir un premier pan-génome des bactéries du genre Wolbachia et d'identifier 2, 5 et 3 gènes présents seulement chez les souches mutualistes, féminisantes ou induisant la mort des mâles. L'expression des gènes potentiellement impliqués dans la féminisation ou le mutualisme a été étudiée au cours du développement de l'hôte. L'étude de l'interactome protéique bactérie-hôte a ensuite été initiée en utilisant comme appât des protéines bactériennes à domaines eucaryotes en vue d'identifier les cibles de Wolbachia chez l'hôte.

La cryptosporidiose est une infection du tube digestif, causée par un protozoaire du genre Cryptosporidium, à l'origine de diarrhées néonatales chez les jeunes ruminants. Cette affection revêt une importance en santé publique et en santé animale, ces deux aspects étant liés par l’existence d'espèces zoonotiques, la principale étant C. parvum. Les données sur l'épidémiologie moléculaire de Cryptosporidium spp chez les ruminants abondent au niveau international mais sont limitées pour la France. Ce travail a confirmé la forte prévalence et les forts niveaux d'excrétion en oocystes de Cryptosporidium chez les jeunes ruminants. L'espèce C. parvum a été identifiée aussi bien chez les veaux, les chevreaux que chez les agneaux. A l'inverse, les espèces C. xiaoi (chez le jeune) et C. ubiquitum (adultes en gestation) n'ont été retrouvées que chez les caprins et les espèces C. bovis et C. ryanae uniquement chez les veaux. Deux espèces zoonotiques ont été identifiées, C. ubiquitum et C. parvum. Tous les sous-types de C. parvum identifiés appartiennent à la famille zoonotique IIa. Le sous-type IIaA15G2R1 a été majoritairement retrouvé quelle que soit l'espèce hôte. Cette observation confirme ce qui a été observé dans d'autres pays à savoir le rôle de réservoir des jeunes ruminants dans la transmission d'isolats de C. parvum à l'homme. Enfin, ce travail a mis en évidence la complexité de l'épidémiologie de l'infection par Cryptosporidium spp avec une évolution de la prévalence et du niveau d'excrétion ainsi que de la distribution des espèces et sous-types de C. parvum d'une année sur l'autre au sein d'un même élevage.

Face à un contexte croissant d'incertitude, les systèmes agricoles doivent être performants, non seulement dans des conditions moyennes, mais aussi quand les perturbations sont plus importantes. Récemment, de nombreux concepts ont été développés pour étudier la durabilité des systèmes dans des environnements changeants, dont celui de robustesse. Néanmoins, son transfert aux systèmes de grandes cultures reste limité. L'objectif de la thèse est alors de proposer un cadre d'évaluation de la robustesse qui soit opérationnel en conditions de grandes cultures. Nous nous sommes focalisés sur la culture du blé tendre et avons défini la robustesse comme la capacité d'un système agricole à maintenir ses performances de rendement malgré l'apparition de perturbations. Un modèle économétrique défini à l'échelle du système de culture a été développé pour évaluer cette robustesse face à des conditions météorologiques et des niveaux de pression maladies changeants. Il a été appliqué sur 145 exploitations agricoles françaises et 2300 parcelles de blé enquêtées sur la période 2011-2014. Les résultats montrent que la robustesse aux perturbations abiotiques et biotiques varie d'un système de culture à l'autre. Les systèmes les plus robustes (respectivement, les moins robustes) ont pu être identifiés, en tenant compte des niveaux de rendement atteints en conditions moyennes et de la sensibilité de ces rendements à des variations climatiques. Alors que les situations de rendements "élevés" versus "faibles" s'expliquent surtout par des pratiques agronomiques dites d'intensification, ce sont surtout des variables dites de flexibilité qui expliquent la robustesse versus la sensibilité aux perturbations abiotiques. Au-delà de l'intérêt de cette approche pour mieux appréhender la robustesse des systèmes agricoles, la méthodologie développée présente l'avantage de pouvoir être appliquée à d'autres performances et/ou d'autres aléas.

La différenciation sexuelle des Isopodes dépend d'une hormone sexuelle protéique, l'hormone androgène (HA), caractéristique des Malacostracés. Cet Insulin-Like Peptide suffit à induire par sa présence la différenciation mâle de ces Crustacés. Nous avons identifié in silico le transporteur circulant de l'HA, l'IGFBP-rP1, chez de nombreuses espèces d'Isopodes ainsi qu'à l'échelle des Crustacés. De la même façon, nous avons identifié deux récepteurs transmembranaires, l'IR1 et l'IR2, issus d'une duplication de gène spécifique des Malacostracés. Les patrons d'expression de ces gènes ont été étudiés sur notre espèce modèle, Armadillidium vulgare. Av-IGFBP-rP1 et Av-IR1 sont exprimés de manière ubiquiste et tout au long du développement. Av-IR2 est aussi exprimé à chaque stade de la différenciation mais ce transcrit est quasi-spécifique des glandes androgènes et ovaires. Une approche par ARNi a confirmé l'implication de ces trois protéines dans la voie de signalisation de l'HA. En effet, l'inhibition de l'HA, Av-IGFBP-rP1 et Av-IR1 provoquent l'hypertrophie des glandes androgènes, suggérant leur implication dans une boucle de rétro-contrôle de l'HA. L'inhibition de Av-IR2 semble seulement provoquer la différenciation d'ouvertures génitales femelles. Ces phénotypes sont comparables à ceux des intersexués mâles induits par la bactérie féminisante endogène Wolbachia. Nous montrons cependant que la bactérie altère seulement l'expression de l'HA et pas celle des récepteurs. Enfin, nous avons testé l'effet du bisphénol A mais nous n'observons pas d'altération de la différenciation sexuelle des larves lors d'expositions à ce perturbateur endocrinien exogène.

L’amélioration génétique de la luzerne (Medicago sativa), une légumineuse fourragère autotétraploïde, pourrait bénéficier de l’allele mining. Cette méthode consiste à rechercher, dans la diversité naturelle, des allèles ayant potentiellement un effet sur le phénotype. Pour évaluer l’intérêt de cette stratégie qui exploite la diversité naturelle, cinq gènes impliqués dans des caractères sélectionnés ont été retenus : CAD1 et CCoaOMT (digestibilité), CONSTANS-like (rendement fourrager), NHX1 (tolérance à la salinité) et WXP1 (tolérance à la sécheresse). La diversité de ces gènes a été étudiée en séquençant 387 génotypes cultivés et 20 génotypes sauvages. L’analyse des données confirme la présence d’un goulot d’étranglement durant la domestication et la sélection de la luzerne. CONSTANS-like et WXP1 révèlent de nombreux variants alors que CAD1, CCoaOMT et NHX1 sont très peu variables. Des variants ayant un effet potentiel sur le phénotype ont été identifiés dans les zones de la séquence protéique qui sont conservées au sein des Faboideae. L’impact sur le phénotype de deux variants du gène CONSTANS-like a été étudié : Constans-634, à l’origine d’un codon stop prématuré et Constans-4111, situé dans une région conservée du gène. Pour cela des croisements ont été réalisés afin d’obtenir une descendance avec toutes les doses possibles (AAAA, AAAB, AABB, ABBB and BBBB) pour chaque mutation étudiée. Des marqueurs KASPar ont été développés afin de déterminer les doses de mutations chez les descendants. Aucun génotype homozygote muté pour Constans-634 n’a été détecté parmi les 1505 descendants. Ce variant a induit une floraison plus précoce de trois jours pour les génotypes portant trois doses d’allèle muté. Le variant Constans-4111 a induit un effet additif sur la hauteur de tige. Les génotypes homozygotes de type sauvage étaient en moyenne 11,8 cm plus petits que les génotypes homozygotes portant trois ou quatre doses du variant. L’intégration de la stratégie allele mining dans les schémas de sélection des espèces végétales autotétraploïdes hétérozygotes a été discutée.

L'accroissement de la population mondiale et le besoin en protéines d'origine végétale ressenti dans le secteur de la nutrition humaine et animale mettent en avant la nécessité de développer de nouvelles méthodes de production de protéines non animales ayant des vertus nutritives et des procédés de production économiques et écoresponsables. Galdieria sulphuraria est une microalgue pouvant être cultivée en bioréacteur de type industriel et sa composition intracellulaire riche en acides aminés essentiels et phycocyanine en fait une source protéique d'intérêt. Cette espèce a la capacité d'utiliser de nombreux substrats carbonés. La consommation de lactose et d'autres sources de carbone organique présentes dans les coproduits d'industrie laitière n'a pas encore été étudiée ni exploitée. La valorisation du lactosérum ou des perméats lactés est l'une des préoccupations environnementales majeures de l'industrie laitière de nos jours, en particulier le lactosérum acide difficile à traiter à cause de ses fortes teneurs en acides organiques. L'objectif de ce travail est de développer un modèle de fermentation industrialisable permettant l'utilisation de ces sous-produits laitiers pour la production de biomasse micro-algale à valeur ajoutée. Ce travail démontre la capacité de G. sulphuraria à consommer 100% du lactose et la majorité des acides organiques présents dans le perméat de lait et à diminuer sa DCO (Demande chimique en oxygène) de 90% au cours du procédé de production. Le procédé de culture en mode chémostat a permis d'atteindre des performances de croissance de 1g/L/h de biomasse sèche avec une production de 0,45-0,5g/L/h de protéines et 25-35mg/L/h de phycocyanine. La caractérisation des systèmes de transport cellulaire de sucres chez G. sulphuraria suggère que le lactose serait absorbé par un système de co-transport sucre/H+ à faible affinité et capable de transporter plus efficacement le glucose et le galactose. Une analyse de l'expression différentielle des gènes en fonction des conditions de culture a révélé que des gènes codant des transporteurs de sucres et des enzymes du métabolisme carboné sont surexprimés en présence de perméat de lait. De même, l'expression de gènes responsables de la production de phycocyanine est induite en mixotrophie et dans un variant producteur de phycocyanine en hétérotrophie. Enfin, l'analyse des propriétés nutritionnelles de la biomasse de G. sulphuraria montre une teneur importante en acides aminés essentiels et une digestibilité des protéines de 92,2% donnant un PDCAAS (Score des Acides Aminés Corrigé en fonction de la Digestibilité des Protéines) de 0,9. Ce produit est également riche en vitamines, fer et magnésium et a des propriétés antioxydantes prouvées in vitro.