UPThèses

Compte tenu des changements climatiques annoncés, les végétaux risquent d'être confrontés, dans un proche avenir, à des épisodes de sécheresse sévères de plus en plus fréquents. Afin de prédire l'impact de telles contraintes sur la productivité et le rendement des plantes cultivées, il convient d'étudier l'effet du manque d'eau sur l'activité photosynthétique, le transport et l'accumulation des sucres. Dans un premier temps, la croissance, le développement, la biomasse et la photosynthèse de huit écotypes d'Arabidopsis thaliana ont été caractérisés. Trois de ces écotypes (Col-0, Mt-0 et Shahdara) ont ensuite été soumis à une période de déficit hydrique. Une chute du contenu relatif en eau des rosettes (RWC), de la conductance stomatique (gs) et de l'assimilation nette (AN) a été observée précocement chez Mt-0, écotype initialement caractérisé par une très faible efficience de l'utilisation de l'eau (AN/E). En réponse au stress, l'analyse des courbes AN/Ci de chaque écotype montrait que la limitation stomatique s'accompagne rapidement de limitations métaboliques (baisse de la Vcmax). En fin de stress hydrique, une diminution des réserves en amidon a conduit dans tous les cas à une accumulation de saccharose dans les feuilles. Les expressions des gènes codant les principaux transporteurs foliaires de sucres (polyols, hexoses et saccharose) étaient quant à eux différemment affectés par le manque d'eau. Shahdara, qui est parvenu à conserver un RWC relativement élevé, est l'écotype qui a le mieux toléré la contrainte hydrique. À l'opposé, Mt-0 présentait, en fin de stress, une inhibition de l'AN couplée à des altérations majeures et irréversibles des photosystèmes II (chutes de qP et de Fv/Fm).

Les fibres longues de chanvre sont des cellules mortes du tissu phloémien, dont ne subsiste que la paroi, essentiellement cellulosique. Elles présentent d'excellentes qualités mécaniques, mais les lots de fibres utilisés sont hétérogènes. Aussi leur caractérisation plus fine est indispensable pour de nouvelles applications notamment comme renfort dans des matériaux composites (but du programme "Compochanvre" de la Région Poitou-Charentes dans lequel s'inscrit cette thèse). L'étude de la répartition des fibres dans la plante en fonction des conditions de culture (serre, champs, apport d'azote et densité de semis) a été menée. Au champ, des conditions de fertilisation moyennes (80 unités d'azote/ha) ont des effets favorables sur la croissance en longueur et en diamètre des tiges et sur le pourcentage de fibres longues. Pour étudier la répartition et le nombre de fibres, des techniques d'imagerie (microscopies photonique et confocale) et d'analyse d'image (Image J) ont été développées. Cela a permis de déterminer un diamètre de Féret de 34 ± 11 μm pour les fibres et de confirmer leur ontologie hloémienne. L'obtention des fibres longues nécessite une étape de rouissage qui favorise leur séparation des autres tissus La caractérisation des fibres longues durant le rouissage a été réalisée selon deux axes principaux : 1 - la caractérisation histologique des fibres, 2 - leur caractérisation biochimique à l'aide des techniques Infra Rouge (Attenuated Total Reflectance et Microspectrométrie Infra Rouge à Transformée de Fourrier). Les résultats obtenus démontrent qu'un rouissage optimal permet d'éliminer les tissus environnants et que les fibres restent groupées en faisceaux et s'enrichissent en cellulose. Ces techniques innovantes pourront être utilisées pour des applications plus industrielles.

Chez les plantes supérieures, la distribution des sucres au sein des cellules est assurée par des protéines membranaires appelées transporteurs. Plusieurs études montrent qu'en plus de leur implication dans le développement, celles-ci ont un rôle au cours des interactions plantes/pathogènes. Le génome de la vigne a permis d'identifier 69 séquences de transporteurs de sucres ainsi que 6 séquences d'intervases chez cette espèce. Le profil d'expression de ces différents gènes a été étudié dans plusieurs oragnaes ainsi qu'en réponse à une contrainte biotique. L'infection de feuilles par Botrytis cinerea a induit une surexpression du transporteur d'hexoses VvHT5 et de l'invertase pariétale VvcwINV1. L'induction des gènes de défense VvPR3 et VvBIG8.1 et la production de resvératrol ont également été mises en évidence. Une suspension cellulaire de vigne cv Chardonnay a été initiée. L'infection des cellules par B. cinerea a induit une surexpression de 3 gènes de transporteurs d'hexoses, VvHT1, -5, -13 , ainsi que de l'invertase pariétale VvcwINV1. L'induction de ces 4 gènes a également été observée en réponse à trois éliciteurs fongiques. Parallèlement à l'induction de ces gènes de transporteurs de sucres, une augmentation de l'influx de glucose a été mesurée dans les cellules élicitées. Ces données indiquent que les transporteurs d'hexoses et les invertases de vigne sont impliqués dans la mise en place des mécanismes de défense lors d'une infection par le champignon nécrotrophe B. cinerea ou lors d'une élicitation. La surexpression de certains gènes de transporteurs de sucres et/ou d'invertases dans des plantules de vigne pourrait démontrer leur rôle dans les phénomènes de tolérance.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, protéine sous membranaire indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Cette déficience augmenterait les influx cationiques par des microruptures de la membrane ou par la dérégulation de canaux tels que les canaux activés par l'étirement (SACs: Stretch-activated channel). Dans ce travail, les effets d'une stimulation mécanique ont été explorés sur des cardiomyocytes dans le contexte pathologique de la cardiomyopathie dilatée associée à la DMD. L'utilisation de fibres de carbone a permis de réaliser un étirement axial similaire aux conditions physiologiques de remplissage ventriculaire. Dans ces conditions, l'exploration de la topographie membranaire par la microscopie de conductance ionique à balayage n'a montré aucune évolution de la surface ni de lésion du sarcolemmel dans les conditions d'étirement. L'étude s'est donc focalisée sur l'activité de candidats moléculaires des SACs et plus particulièrement ceux appartenant à la famille des TRPs (Transient Receptor Potential) dans le dérèglement de l'homéostasie calcique induite par l'étirement. Les influx cationiques évalués par la technique d'extinction de fluorescence et l'étude de la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i) grâce à la sonde Fluo8 montrent une implication des canaux TRPV2 et TRPCs. Les premiers semblent responsables d'une entrée cationique et d'une augmentation de [Ca2+]i importante dans les cardiomyocytes mdx. Les seconds, bien que responsables d'un influx, ne participeraient pas à l'augmentation de [Ca2+]i. Ces résultats révèlent que les canaux TRPV2 pourraient jouer un rôle important dans la dérégulation calcique observée dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine.

Le calcium est un messager intracellulaire secondaire impliqué dans le contrôle de nombreux processus biologiques. Un mauvais contrôle de sa concentration peut conduire à la mort cellulaire. Pour ce faire, le Ca2 + est stocké dans les compartiments intracellulaires tel que le réticulum endoplasmique (RE). La mucoviscidose (CF) est une maladie génétique résultant de la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Chez une majorité de patients (92%), il est retrouvé une délétion d'un résidu phénylanine en position 508. La protéine ainsi délétée (F508del-CFTR) se retrouve retenue dans le RE par des protéines chaperonnes dépendantes du Ca2 + Dans un premier temps, nous avons caractérisé et comparé l'homéostasie calcique des cellules épithéliales CF et non FC, précisément au niveau : du ER, de la membrane plasmique et pour finir au niveau des mitochondries. Puis, nous avons regarder les conséquences sur l'homéostasie calcique de la correction du défaut de l'adressage défectueux de la protéine F508del-CFTR (correction pharmacologique ( miglustat) ou par une incubation 24 heures à 27 ° C) . Nous avons mis en évidence l'implication de 3 isoformes de recepteurs à l'IP3 (RIP3),des canaux calciques membranaires TRPC1 et TRPC6, ainsi qu'une participation des mitochondries. Dans la mucoviscidose, les RIP3s, les canaux TRPC6 apparaissent suractivés. Il semble que le contenu en cholestérol de la membrane plasmique joue un rôle primordial dans la régulation du TRPC6. tandis que le pouvoir tampon calcique des mitochondries apparaît diminué dans les cellules CF. Le contrôle du signal calcique des cellules mucovisidosiques apparaît fortement perturbé. Ces perturbations du signal calcique pourraient avoir de nombreuses implications dans la physiopathologie de la mucoviscidose, notamment au niveau de l'état inflammatoire des cellules mucoviscidosiques.

L'objectif de cette thèse était de développer et de caractériser un modèle de cellules souches cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire. Après avoir sélectionné et caractérisé une population de cellules souches d'origine mésenchymateuse, isolée à partir d'auricules humaines, exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d'immuno-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1. la caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs de la signalisation calcique et 2. l'étude de leur différenciation in vitro en parallèle à l'activité calcique intracellulaire. Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker. Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, Kv, NCX, s'expriment durant la différenciation. L'enregistrement de l'activité calcique (via une sonde optogénétique) montre la présence d'oscillations calciques qui évoluent en fréquence et en intensité pendant la différenciation. Les stocks-IP3 sensibles et l'échangeur NCX joueraient un rôle fondamental. Nous avons ensuite étudié l'importance du canal BKCa et des récepteurs sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+. L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-renouvellement mais n'affecte pas la migration. Quant à la S1P elle freine la prolifération et l'auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3. Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque.

Dans le coeur, les fibroblastes représentent la population cellulaire majoritaire en nombre. Ces dernières années, des études ont révélé un rôle important de ces cellules dans le fonctionnement normal et pathologique du coeur. Les fibroblastes sont physiologiquement la source de nombreux facteurs autocrines et paracrines. Ils sont également à la base du renouvellement de la matrice extra-cellulaire (MEC). En réponse à un stress pathologique, ils peuvent subir un processus de différenciation en myofibroblastes et une altération de leurs propriétés et de leur fonction à l'origine d'un dysfonctionnement cardiaque. Bien que les fibroblastes soient considérés comme des cellules non excitables, des études ont révélé ces dernières années l'expression fonctionnelle de différents canaux ioniques sur leur membrane. L'objectif de ma thèse a été d'une part de caractériser au niveau moléculaire et fonctionnel de nouvelles conductances dans les fibroblastes cardiaques et d'autre part d'évaluer leur impact sur les propriétés fonctionnelles de ces cellules. Un criblage par PCR à haut rendement a permis de révéler l'expression d'un ensemble de gènes codant des sous-unités canalaires dans les fibroblastes cardiaques. Parmi ces gènes, ceux codant les sous-unités SUR2 et Kir6.1 ont le niveau d'expression le plus élevé. L'association des unités SUR2 et Kir6.1 étant connue pour former un canal potassique, nous avons focalisé notre intérêt sur ces deux sous-unités. Des analyses par western-blot ont montré une augmentation progressive de l'expression des unités SUR2 et Kir6.1 au cours de la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes...

La mucoviscidose résulte de la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) induisant un défaut de sécrétion des ions chlorure à la membrane apicale des épithéliums respiratoires, digestifs et reproducteurs. L'objectif de ce travail était de caractériser des molécules capables de restaurer une sécrétion chlorure dans des modèles mucoviscidosiques in vitro, ex vivo et in vivo. Dans un premier temps, nous avons identifié deux composés de la famille des adduits méthylglyoxalalpha-aminoazahétérocycle (ie le GPact-11a et le GPact-26a) comme activateurs non-toxiques et hydrosolubles des CFTR sauvages et F508del. Dans une seconde partie de l'étude, nous avons identifié un nouvel activateur des canaux TRPC6 : le guanabenz. Nous avons mis en évidence que le guanabenz induit l'activation des canaux chlorures calcium-dépendant (CaCC) via une entrée de calcium extracellulaire par le canal TRPC6. La restauration de la sécrétion chlorure grâce à l'activation du F508del-CFTR ou du CaCC représente une approche pharmacologique efficace et mesurable pour le traitement de la mucoviscidose. De plus, l'identification d'une nouvelle voie d'activation du CaCC via TRPC6 représente une avancée scientifique pouvant se répercuter sur d'autres pathologies.

La protéine transmembranaire CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), impliquée dans la mucoviscidose est un canal chlorure régulée par l'ATP et l'AMPc. Les mécanismes de régulation des processus d'ouverture/fermeture du canal ne sont pas encore clairement démontrés mais depuis quelques années, les nouvelles données sur la structure moléculaire de la protéine ont permis des avancés dans ce domaine. Les objectifs de ce travail de recherche ont été de caractériser, par une étude de relation structure/fonction, le rôle de l'extrémité C-terminale du NBD1 et de son environnement moléculaire dans la régulation de la maturation ou de l'activité du canal ainsi que dans sa pharmacologie. Certains résidus déterminés par l'exploration des modèles moléculaires ont été mutés par mutagenèse dirigée puis les conséquences de ces mutations ont été analysées par les techniques de western blot, de patch clamp et d'efflux d'iodure. Nos travaux ont permis de mettre en évidence l'importance de l'intégrité de la structure en épingle à cheveux de l'extrémité C-terminale du NBD1 ainsi que de ses différentes liaisons, dans la maturation et l'activité du canal. Concernant le mécanisme d'action des composés MPB, composés à double action (activateur et correcteur de CFTR), nous avons montré que la perturbation directe de la structure de la β-hairpin rendait l'action des composés impossible alors que la perturbation de la liaison avec le Walker A du NBD2 induisait une meilleure action des MPB. Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence un rôle important de l'extrémité C-terminale du NBD1 dans la régulation de l'adressage, de l'activité et de la pharmacologie du canal CFTR.

La mucoviscidose est une maladie génétique autosomale récessive induite par des mutations du gène codant pour le canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Parmi les mutations les plus fréquentes, la délétion d’une phénylalanine en position 508 conduit à un défaut d’adressage de la protéine consécutif à sa rétention dans le réticulum endoplasmique. Bien que les mécanismes d’action soient encore largement méconnus, de nombreuses petites molécules appelées correcteurs (VX809, SAHA, Corr4a, iminosucres…) ont été identifiées pour corriger individuellement le défaut d’adressage et ainsi restaurer une partie de l’activité de F508del-CFTR. Dans une première partie, nous avons montré qu’en combinant de manière appropriée ces correcteurs, il est possible d’optimiser la restauration fonctionnelle de F508del-CFTR. Cependant, parmi ces composés, aucun de ne présentant de réels bénéfices cliniques. Ainsi, nous avons exploité les modèles de structure 3D de la protéine WT- et F508del-CFTR afin d’identifier un site d’intérêt (cavité F508del-CFTR) pour la conception de composés actifs et en particulier de correcteurs. Cette stratégie a conduit (1) à la conception de nouvelles molécules originales (2) à la synthèse de ces composés (3) à leur test sur la restauration fonctionnelle de F508del-CFTR. Les résultats obtenus par les techniques de Western-Blot, d’efflux d’iodure et d’électrophysiologie ont permis de montrer qu’il est possible, sur la base du modèle de structure 3D de la protéine et d’expériences d’amarrage moléculaire, de créer des molécules capables de restaurer les défauts d’adressage et de fonctionnalité de F508del-CFTR.