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Brot Sébastien

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  • Modelling Parkinson's disease with patient induced pluripotent stem cells    - Thamrin Nabila Pyrenina  -  10 mars 2022

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    La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative motrice liée à l'âge qui touche près de 1% de la population de plus de 60 ans, caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) dans la substance noire. La majorité des cas de la MP sont sporadiques, cependant, 5 à 10 % des cas sont liés à des mutations au niveau de gènes spécifiques et sont alors qualifiés de forme familiale. Des mutations de la protéine parkine sont la cause génétique la plus courante de la forme familiale de la MP. L'absence d’une compréhension claire de la manière dont cette mutation provoque la MP entrave le développement de thérapies curatives de la maladie. La découverte des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permet de générer des neurones dopaminergiques (DA) spécifiques aux patients afin d'étudier comment la mutation de parkine cause la MP. Les objectifs de cette étude sont d'obtenir des CSPi à partir de fibroblastes dermiques de patients présentant différentes mutations de parkine et de sujets normaux comme contrôle, de générer des neurones DA à partir de CSPi spécifiques de patients, et d'étudier in vitro et in vivo l'impact de la mutation de parkine sur la survie, la maturation et le dysfonctionnement mitochondrial des neurones DA. Nous avons utilisé des fibroblastes dermiques humains transfectés avec un plasmide codant pour les facteurs de Yamanaka (Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc), afin de les reprogrammer en CSPi. A partir de ces CSPi, nous avons obtenu des neurones DA en passant par une différenciation de cellules de la plaque du plancher. Dans un premier temps, nous avons étudié l'impact des mutations de parkine in vitro sur la survie cellulaire, la différenciation, la maturation et la fonction mitochondriale de neurones DA dérivés de patients présentant une mutation de parkine et de sujets témoins. Après différenciation, plus de 70% des cellules générées expriment des marqueurs de précurseurs de DA tels que FOXA2, OTX2 & LMX1A chez les deux types de sujets. Cependant, nous avons observé une réduction importante du nombre de cellules exprimant les marqueurs DA matures, lorsqu’elles sont dérivées de patients atteint de la mutation de parkine. L’altération mitochondriale a été analysée en utilisant l'anticorps Cytochrome-C et un marqueur de potentiel de membrane : MitoTracker. Au stade de précurseur de DA, environ 80% des mitochondries étaient métaboliquement actives chez les deux sujets. Cependant, au stade de la maturation, nous avons observé une diminution de 15-25% de l'activité mitochondriale dans les cellules du patient présentant une mutation de parkine. La détection de l'apoptose à l'aide du test TUNEL ou de l'annexin-V a montré une apoptose 20% plus élevée dans les cellules du patient. Dans un deuxième temps, nous avons transplanté des précurseurs de DA dérivés de patients et de témoins dans la substantia nigra d'un modèle murin de la MP. Un mois après la greffe, nous avons trouvé une réduction de 5 fois du nombre de neurones matures DA dans les greffes de cellules issus d’un patient par rapport au contrôle. Cette approche nous a permis d’étudier des résultats à plus long terme qu’in vitro. De façon intéressante, il n'y avait pas de différence entre les deux sujets en ce qui concerne la prolifération cellulaire et la maturation neuronale. Nos résultats indiquent que la mutation de parkine induit à une accumulation de mitochondries défectueuses conduisant à la mort cellulaire, en particulier dans les neurones DA. Nous avons montré que la combinaison de neurones DA dérivés de patients de la MP avec mutation de parkine et la transplantation permettrait d'étudier les conséquences à long terme de la mutation sur le développement des neurones DA.

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