UPThèses

En dépit des progrès réalisés ces dernières décennies, le cancer demeure un problème majeur de santé publique. La plupart des chimiothérapies conventionnelles exploitent les propriétés cytotoxiques d'agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu'elles soient cancéreuses ou non, ce qui peut aboutir à une toxicité importante et de sévères effets secondaires. Pour pallier à ce problème, l'utilisation de ligands de ciblage pour délivrer spécifiquement l'agent cytotoxique aux cellules malignes tout en épargnant les tissus sains est une approche prometteuse. Parmi les différents ligands exploités, l'acide folique fait l'objet d'une attention particulière due à la surexpression préférentielle de son récepteur par de nombreux types de cellules cancéreuses. Cependant, les essais cliniques menés sur des molécules reposant sur cette stratégie indiquent que leur efficacité dépend surtout du niveau d'expression du récepteur ciblé. Dans ce contexte, j'ai développé deux approches permettant d'augmenter l'efficacité du ciblage des récepteurs à l'acide folique. D'une part, j'ai réalisé la validation biologique de nouveaux conjugués conçus pour délivrer conjointement deux agents anticancéreux. D'autre part, j'ai mis au point un traitement capable d'augmenter, in vitro et in vivo, l'expression des récepteurs à l'acide folique à la surface des cellules tumorales. Cela aboutit à l'internalisation d'une plus grande quantité de vecteur, qui se traduit in vivo, par une inhibition plus importante de la croissance tumorale, sans toxicité sur les cellules saines.

Les amibes libres sont des microorganismes unicellulaires eucaryotes dont l'écologie au sein des réseaux d'eau potable est mal connue. Les amibes libres représentent un enjeu de santé publique, du fait de leur capacité à favoriser la présence de bactéries potentiellement pathogènes, parmi lesquelles des mycobactéries. Une campagne de prélèvement menée sur le réseau d'eau potable de Paris a permis d'évaluer la diversité des amibes libres et de leur microbiome bactérien, par pyroséquençage ciblant les gènes ribosomaux (16S et 18S). Ces analyses ont suggéré la prédominance des genres Acanthamoeba, Vermamoeba, Echinamoeba et Protacanthamoeba. Le microbiome des amibes a révélé une grande diversité bactérienne, dominée par Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bradyrhizobium, Sphingomonas et Pseudoxanthomonas. L'intégration des paramètres physicochimiques a permis de suggérer l'importance de l'origine de l'eau, la température, le pH et la concentration en chlore dans la dynamique des populations amibiennes. Une endosymbiose originale entre V. vermiformis et des bactéries du phylum TM6 a également été mise en évidence. Les amibes ont été fréquemment co-isolées avec des mycobactéries dans le réseau, principalement les espèces M. llatzerense et M. chelonae. Des expériences d'infection chez A. castellanii ont permis d'observer la capacité de ces mycobactéries à survivre et croitre en présence d'amibes. Par génomique comparative et analyses transcriptomiques, plusieurs facteurs de virulence, conservés entre M. llatzerense, M. chelonae et M. tuberculosis, ont été identifiés et sont surexprimés au cours de l'infection. Ces données suggérent leur implication dans la résistance à la prédation amibienne. L'ensemble de ces travaux a permis d'améliorer la connaissance des populations amibiennes et de leur microbiome au sein du réseau d'eau potable, apportant des éléments supplémentaires concernant leur implication dans la survie et la persistance des mycobactéries.

L. pneumophila est une bactérie ubiquitaire des environnements aquatiques, responsable de la légionellose. Elle est principalement retrouvée au sein de protozoaires, mais aussi dans les biofilms. Il est admit que le fer est l'un des éléments indispensable à la croissance de ce pathogène. En 2008, une étude a été réalisée au sein de notre équipe montrant une modulation de l'expression des gènes entre L. pneumophila à l'état planctonique, et à l'état de biofilm. Dans cette même étude, l'ajout de forte concentration en fer (1,25 g/l), dans le milieu de culture des biofilms, a révélé une inhibition de leur développement. Le fer présente donc un rôle dans l'établissement de biofilms mono espèces de L. pneumophila. Nous avons développé un modèle de biofilms naturels, formés à partir d'eau de rivière, afin de tester l'établissement de L. pneumophila, dans des conditions où l'eau de rivière est supplémentée en fer ou au contraire appauvrit, par l'ajout de chélateurs, le deferoxamine mesylate (DFX) ou le dipyridyl (DIP). Les ajouts de fer et de DFX n'ont eu aucun impact sur l'établissement de L. pneumophila contrairement au DIP, qui a induit une augmentation de l'implantation de ces bactéries. Par ailleurs, nous avons effectué une analyse transcriptomique sur L. pneumophila cultivées en milieu liquide supplémenté en DFX. L'ajout du chélateur a entrainé une induction de l'expression de 113 gènes et la répression de 246 gènes. Parmi les gènes induits, certains sont déjà connus comme étant impliqués dans le métabolisme du fer ou contrôlés par le fer. Parmi eux, un gène a été surexprimé, il n'a jamais été associé au fer et sa fonction est encore inconnue à ce jour. Il s'agit du gène lpp2867. Des investigations ont été réalisées afin de caractériser et de comprendre le rôle de la protéine pour laquelle il code. Elle est notamment impliquée dans l'infection des amibes et des macrophages. Son rôle dans le transport du fer ferreux a également été mis en avant. Cette protéine a été nommée IroT pour « iron transporter ».

Pour croître et proliférer, les cellules cancéreuses de la prostate activent des voies de signalisation dépendantes des androgènes. L'intervention thérapeutique en première ligne du cancer de la prostate (CaP) s'appuie donc d’abord sur le blocage de l'axe androgènes-récepteur aux androgènes (RA) mais rapidement, les patients développent des tumeurs résistantes (CRPC, Castration Resistant Prostate Cancer). Les récepteurs à activité tyrosine kinase de la famille ErbB semblent jouer un rôle dans cette résistance, en particulier le récepteur ErbB3. En effet, l'inactivation des voies en aval d'ErbB1 et ErbB2, en association avec les anti-androgéniques n'empêche pas la progression vers l'hormono-indépendance, et une accumulation nucléaire d'ErbB3 est observée dans les CRPC en même temps que la voie PI3K-Akt est réactivée. Dans ce contexte, nous avons validé l'expression d'une isoforme nucléaire ErbB380kDa chez les patients et dans des lignées hormono-sensible (LNCaP) et hormono-résistante (PC3). Par ChIP-on-chip, nous avons isolé 353 promoteurs cibles communs aux deux lignées, 245 spécifiques à la lignée LNCaP et 925 à la lignée PC3, et montré qu'ErbB380kDa est un co-régulateur transcriptionnel des gènes étudiés, parmi lesquels GATA2. L'analyse in silico de ces promoteurs révèle des sites de liaison pour les facteurs de transcription GATA2 et MZF1 au niveau des régions liant ErbB380kDa. Un complexe nucléaire GATA2-MZF1-ErbB380kDa est retrouvé dans les cellules LNCaP et PC3. Des travaux récents montrent que GATA2 s'associe au RA pour réguler l'expression de gènes et qu'il pourrait être participer à la dissémination métastatique dans le CaP. Nos résultats suggèrent qu'ErbB380kDa pourrait jouer un rôle régulateur, en amont de GATA2, dans les processus de résistance et l'apparition de métastases. Cette isoforme nucléaire insensible aux traitements actuels apparaît donc comme une cible privilégiée pour le ciblage thérapeutique.

La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies rares chez la population caucasienne. Cette maladie héréditaire récessive est causée par des mutations du gène Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) qui code pour une protéine localisée au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. La sévérité du phénotype est déterminée par les classes des mutations et leurs combinaisons en trans, ainsi que par la présence d'allèles complexes. La détermination des effets d'une mutation est essentielle pour avoir une corrélation génotype/phénotype correcte, donner un diagnostic prénatal adapté et permettre aux cliniciens de prescrire le traitement approprié à chaque mutation quand celui-ci sera disponible. Pour cela, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations qui intéressent le laboratoire : c.1392G>T (p.Lys464Asn), c.3909C>G (p.Asn1303Lys) et c.965T>C (p.Val322Ala). L'effet de ces mutations sur la protéine a été évalué. De plus, l'impact sur l'épissage aberrant des deux premières mutations, seules et dans le cadre de leurs allèles complexes, a été déterminé. Nous avons montré que : 1) la mutation c.1392G>T est de classe V et II et son allèle complexe aggrave l'épissage aberrant, 2) la mutation c.3909C>G appartient à la classe II et l'effet sur l'épissage résulte de son allèle complexe et 3) la mutation familiale c.965T>C est un simple polymorphisme. Ces travaux montrent l'importance de l'étude d'une mutation à différents niveaux cellulaires par l'intermédiaire des analyses in silico, in cellulo et in vivo et soulignent l'effet des allèles complexes qui peuvent moduler l'impact de la mutation seule.

Legionella pneumophila est une bactérie intracellulaire facultative retrouvée aussi bien dans les environnements aqueux naturels qu'artificiels. Cette bactérie est l'agent de la légionellose, une pneumopathie sévère. Les milieux aqueux sont colonisés par des biofilms, une association de micro-organismes enveloppés d'une matrice exopolymérique. Les légionelles sont capables de coloniser et de survivre au sein de ces biofilms. Dans les réseaux d'eaux, les biofilms sont la cible de la prédation des amibes qui se retrouvent ensuite parasités par les légionelles et favorisent ainsi leur multiplication. Nous avons étudié l'impact de l'origine de la multiplication des légionelles sur la colonisation et la formation de biofilms. Notre étude a démontré que dans tous les cas les légionelles sont présentes à la surface de biofilms préformés. Notre étude a mis en évidence que les légionelles issues de la multiplication au sein d'amibes sont capables de former des agrégats compacts empaquetés dans une matrice exopolysaccharidique. Ce phénotype « biofilm » se manifeste après induction par une molécule amibienne en cours de caractérisation. De plus, notre étude a mis en évidence l'existence d'un nouveau système de communication de type Quorum Sensing permettant une communication inter et intra-espèce qui permet l'induction de ce phénotype chez les légionelles.

V. vermiformis est une amibe libre répandue dans l'environnement et les milieux artificiels comme les réseaux d'eau chaude sanitaire (RECS). Il est maintenant bien établi qu'elle joue un rôle de réservoir pour des bactéries pathogènes, comme L. pneumophila. Le contrôle de V. vermiformis dans les RECS représente donc un enjeu sanitaire important. Les amibes libres peuvent passer d'une forme métaboliquement active (trophozoïte) à une forme de résistance, le kyste, lorsque les conditions sont défavorables ce qui leur confère une résistance aux traitements. Malgré la haute prévalence de V. vermiformis dans les RECS, les processus de différenciation et la résistance de ses kystes aux traitements n'ont été que peu étudiés. Nous avons donc investigué les changements morphologiques et ultrastructuraux qui s'opèrent lors de l'enkystement et désenkystement de V. vermiformis. Il en ressort que l'enkystement est un phénomène rapide (9 h) qui conduit à la formation de kystes entourés d'une paroi double couche. Lors du désenkystement, les trophozoïtes n'émergent pas à travers un ostiole comme c'est le cas chez Acanthamoeba. Puis, nous avons étudié l'effet des conditions environnementales et de la concentration cellulaire sur l'enkystement. Nous avons observé que plus la concentration cellulaire est élevée plus l'enkystement est rapide, ce qui suggère l'existence de mécanismes de communication intercellulaire. Enfin, nous avons étudié la résistance des kystes aux traitements utilisés dans les RECS et aux protéases. Ces traitements étaient efficaces, in vitro, pour inactiver les kystes de V. vermiformis. Ces travaux ont permis d'apporter des connaissances de bases sur les processus de d

Legionella est une bactérie pathogène, ubiquitaire des environnements aqueux. L'utilisation des eaux de surface, par les centrales nucléaires, provoque un réchauffement de ces eaux, qui associé aux conditions de fonctionnement peut entraîner sa prolifération. Afin de limiter le développement de cette bactérie, en deçà des seuils réglementaires, EDF met en œuvre un traitement à la monochloramine dans ses circuits. Notre étude a eu pour but d’améliorer les connaissances sur les associations entre les légionelles et leur principal hôte : les amibes, et sur les facteurs susceptibles d’influencer leur sensibilité au traitement biocide. Nous avons, tout d’abord, mis en évidence la permissivité de 12 souches d’amibes à 2 souches de L. pneumophila. La température est apparue comme le paramètre le plus influant, la prolifération de Legionella semble favorisée à 40°C. Puis, nous avons cherché à développer un protocole pour séparer Legionella selon son état d’association. Ce protocole n’est pas abouti à l’heure actuelle. Finalement, nous avons comparé la sensibilité, de Legionella, dans différents états physiologiques et étudié l’impact de la qualité de l’eau et des MES. Les cellules post-amibes et dans une moindre mesure, les cellules en phases stationnaires sont les moins sensibles. L’effet de la matrice a été mis en évidence pour l’eau de Vienne, par contre la sensibilité n’a pas été modifiée suite à l’élimination ou l’enrichissement en MES. Cette étude constitue une base de connaissances nouvelles pour orienter les choix de gestion du traitement anti-Legionella à la monochloramine et d’exploitation des circuits.

L'environnement des stations thermales est favorable à la croissance des Legionella. La Tunisie compte de nombreux sites thermaux. Elle a par ailleurs développé une médecine traditionnelle à base de plantes. L'objectif de ce travail était de caractériser des souches de légionelles isolées de stations thermales et d'étudier le potentiel antimicrobien d'HE de plantes tunisiennes. 2 souches de L. londiniensis et 16 de L. pneumophila (sérovars 1, 4, 5, 6 et 8) ont été isolées de 3 stations thermales tunisiennes et avaient des pulsotypes différents de ceux de la base du CNRL. Les HE de 6 plantes tunisiennes ont été extraites, analysées (GC-MS) et testées contre L. pneumophila (8 souches, sérovars 1, 4, 5, 6 et 8). Les HE de Juniperus phoenicea L. (isobornéol 20,91% et 1S α-pinène 18,30%) et Thymus vulgaris (carvacrol 88,50%) étaient les plus actives (CMI <0,03 mg/mL et ≤0,07 mg/mL respectivement). L'activité de 20 HE (6 de plantes tunisiennes et 14 commerciales) a été évaluée contre 11 espèces bactériennes (6 Gram+, 5 Gram-) et 7 fongiques (4 levures, 3 filamenteux). L'HE de T. vulgaris tunisien était la plus active (Gram-: CMI ≤0,34 mg/mL ; Gram+: CMI ≤0,7 mg/mL ; levures: CMI ≤0,55 mg/mL ; moisissures: CMI=0,3 mg/mL ; dermatophytes: CMI ≤0,07 mg/mL). Elle a montré une activité très supérieure à celle de l'HE commerciale de T. vulgaris certainement due à sa composition différente. En conclusion, la présence de Legionella dans les sites étudiés doit encourager les autorités à renforcer les mesures préventives et l'efficacité antimicrobienne des HE, en particulier l'HE de T. vulgaris tunisien, suggère leur possible intérêt dans le traitement des eaux ou la conservation des aliments.

Le diabète de type 2 (DT2) représente un enjeu de santé publique au regard de ses complications, qui sont des maladies complexes, où interagissent des déterminants génétiques et environnementaux. L'objectif de ce travail était d'étudier ces déterminants dans trois populations indépendantes de patients DT2 en couplant études transversales (DIAB2NEPHROGENE) et longitudinales (SURDIAGENE et DIABHYCAR) totalisant 7767 sujets. Via une approche gène-candidat, nous avons focalisé nos recherches sur le système des peptides natriurétiques, le gène NPR3 (codant le récepteur de clairance aux peptides natriurétiques) et les apports sodés puis la voie métabolique des hormones sexuelles, le gène CYP19A1 (codant l’aromatase) et les concentrations de stéroïdes sexuels. Nous avons montré que l'allèle G du rs2270915 du NPR3 est un allèle de risque de pression artérielle (PA) plus élevée et de moindre sensibilité pressive à la réduction sodée qui ne confère pas d'augmentation significative de risque d'évènements cardiovasculaires (ECV) contrairement au rs6889608. Enfin, la survie sans ECV est significativement modulée par les apports en sel avec un risque de morbi-mortalité réduit chez les sujets diabétiques consommant le plus de sel malgré un niveau de PA plus élevé. Nous avons confirmé que le sexe masculin est un facteur de risque pour la néphropathie diabétique (ND) mais également pour la survenue d'ECV. Nous avons montré, chez les hommes, que des concentrations plus élevés d'oestradiol s'associent à une prévalence plus importante de ND mais ne se traduisent pas par une augmentation des événements rénaux ou cardiovasculaires. CYP19A1 n'est associé ni avec les niveaux d'oestradiol, ni avec la prévalence ou la sévérité de la ND. Deux SNP s'associent toutefois significativement avec la survenue d'insuffisance rénale chronique terminale. Au total, nous avons identifié dans 2 voies métaboliques distinctes des déterminants génétiques de complications du DT2 ainsi qu'une interaction gène-environnement.