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Section 64 - Biochimie et biologie moléculaire

Les thèses se rapportant à la section CNU "Section 64 - Biochimie et biologie moléculaire"

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  • Etude de l'état viable non cultivable (VBNC) chez Legionella pneumophila Lens après traitements monochloramine et thermique    - Alleron Laëtitia  -  08 février 2008

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    Legionella pneumophila, l'agent responsable d'une pneumonie sévère atypique chez l'homme, appelée maladie du légionnaire, est ubiquitaire dans les environnements aquatiques. Les traitements généralement appliqués dans les réseaux d'eau afin d'éradiquer cette bactérie sont souvent suivis d'une recolonisation rapide de cette bactérie. Un des facteurs pouvant expliquer cette recolonisation peut être l'état Viable Non Cultivable (VBNC).L'objectif de nos travaux a été d'étudier la survie de L.pneumophila après des traitements oxydant et thermique et notamment d'étudier l'état VBNC. Dans un premier temps nous avons réalisé un traitement monochloramine et un traitement thermique sur une suspension de légionelles. Nous avons observé que le traitement par 20 mg/L de monochloramine ainsi que celui à 57,5°C, conduisaient à la formation de VBNC chez L. pneumophila. De plus ces bactéries peuvent persister dans cet état pendant au moins 169 jours après traitement.Dans un second temps, une étude partielle des protéines exprimées à l'état VBNC a été menée. Nous avons montré que l'expression de plusieurs protéines, impliquées dans les voies de production d'énergie, de synthèse protéique et dans la virulence, était augmentée d'un facteur supérieur ou égale à deux par comparaison avec des bactéries ayant subies un stress monochloramine ou une carence en nutriments.Dans un troisième temps, la recherche d'un facteur de ressuscitation Rpf a été entreprise chez L. pneumophila. Un gène Rpf-like, possédant 33% d'identité et 51% de similarité avec celui de Salmonella, a été découvert. Ce gène a été cloné mais la protéine recombinante obtenue n'a pas conduit à un retour à la cultivabilité des cellules.

  • Impact de la multiplication chez l'hôte Acanthamoeba castellanii sur le développement de biofilms chez Legionella pneumophila    - Bigot Renaud  -  12 décembre 2013

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    Legionella pneumophila est une bactérie intracellulaire facultative retrouvée aussi bien dans les environnements aqueux naturels qu'artificiels. Cette bactérie est l'agent de la légionellose, une pneumopathie sévère. Les milieux aqueux sont colonisés par des biofilms, une association de micro-organismes enveloppés d'une matrice exopolymérique. Les légionelles sont capables de coloniser et de survivre au sein de ces biofilms. Dans les réseaux d'eaux, les biofilms sont la cible de la prédation des amibes qui se retrouvent ensuite parasités par les légionelles et favorisent ainsi leur multiplication. Nous avons étudié l'impact de l'origine de la multiplication des légionelles sur la colonisation et la formation de biofilms. Notre étude a démontré que dans tous les cas les légionelles sont présentes à la surface de biofilms préformés. Notre étude a mis en évidence que les légionelles issues de la multiplication au sein d'amibes sont capables de former des agrégats compacts empaquetés dans une matrice exopolysaccharidique. Ce phénotype « biofilm » se manifeste après induction par une molécule amibienne en cours de caractérisation. De plus, notre étude a mis en évidence l'existence d'un nouveau système de communication de type Quorum Sensing permettant une communication inter et intra-espèce qui permet l'induction de ce phénotype chez les légionelles.

  • Occurrence des légionelles dans les eaux thermales tunisiennes et évaluation de l'activité anti-legionella des huiles essentielles de plantes autochtones    - Chaftar Nawel  -  06 novembre 2013

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    L'environnement des stations thermales est favorable à la croissance des Legionella. La Tunisie compte de nombreux sites thermaux. Elle a par ailleurs développé une médecine traditionnelle à base de plantes. L'objectif de ce travail était de caractériser des souches de légionelles isolées de stations thermales et d'étudier le potentiel antimicrobien d'HE de plantes tunisiennes. 2 souches de L. londiniensis et 16 de L. pneumophila (sérovars 1, 4, 5, 6 et 8) ont été isolées de 3 stations thermales tunisiennes et avaient des pulsotypes différents de ceux de la base du CNRL. Les HE de 6 plantes tunisiennes ont été extraites, analysées (GC-MS) et testées contre L. pneumophila (8 souches, sérovars 1, 4, 5, 6 et 8). Les HE de Juniperus phoenicea L. (isobornéol 20,91% et 1S α-pinène 18,30%) et Thymus vulgaris (carvacrol 88,50%) étaient les plus actives (CMI <0,03 mg/mL et ≤0,07 mg/mL respectivement). L'activité de 20 HE (6 de plantes tunisiennes et 14 commerciales) a été évaluée contre 11 espèces bactériennes (6 Gram+, 5 Gram-) et 7 fongiques (4 levures, 3 filamenteux). L'HE de T. vulgaris tunisien était la plus active (Gram-: CMI ≤0,34 mg/mL ; Gram+: CMI ≤0,7 mg/mL ; levures: CMI ≤0,55 mg/mL ; moisissures: CMI=0,3 mg/mL ; dermatophytes: CMI ≤0,07 mg/mL). Elle a montré une activité très supérieure à celle de l'HE commerciale de T. vulgaris certainement due à sa composition différente. En conclusion, la présence de Legionella dans les sites étudiés doit encourager les autorités à renforcer les mesures préventives et l'efficacité antimicrobienne des HE, en particulier l'HE de T. vulgaris tunisien, suggère leur possible intérêt dans le traitement des eaux ou la conservation des aliments.

  • Diversité et implication des amibes libres dans la survie et la persistance des mycobactéries non tuberculeuses au sein d'un réseau d'eau potable    - Delafont Vincent  -  21 octobre 2015

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    Les amibes libres sont des microorganismes unicellulaires eucaryotes dont l'écologie au sein des réseaux d'eau potable est mal connue. Les amibes libres représentent un enjeu de santé publique, du fait de leur capacité à favoriser la présence de bactéries potentiellement pathogènes, parmi lesquelles des mycobactéries. Une campagne de prélèvement menée sur le réseau d'eau potable de Paris a permis d'évaluer la diversité des amibes libres et de leur microbiome bactérien, par pyroséquençage ciblant les gènes ribosomaux (16S et 18S). Ces analyses ont suggéré la prédominance des genres Acanthamoeba, Vermamoeba, Echinamoeba et Protacanthamoeba. Le microbiome des amibes a révélé une grande diversité bactérienne, dominée par Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bradyrhizobium, Sphingomonas et Pseudoxanthomonas. L'intégration des paramètres physicochimiques a permis de suggérer l'importance de l'origine de l'eau, la température, le pH et la concentration en chlore dans la dynamique des populations amibiennes. Une endosymbiose originale entre V. vermiformis et des bactéries du phylum TM6 a également été mise en évidence. Les amibes ont été fréquemment co-isolées avec des mycobactéries dans le réseau, principalement les espèces M. llatzerense et M. chelonae. Des expériences d'infection chez A. castellanii ont permis d'observer la capacité de ces mycobactéries à survivre et croitre en présence d'amibes. Par génomique comparative et analyses transcriptomiques, plusieurs facteurs de virulence, conservés entre M. llatzerense, M. chelonae et M. tuberculosis, ont été identifiés et sont surexprimés au cours de l'infection. Ces données suggérent leur implication dans la résistance à la prédation amibienne. L'ensemble de ces travaux a permis d'améliorer la connaissance des populations amibiennes et de leur microbiome au sein du réseau d'eau potable, apportant des éléments supplémentaires concernant leur implication dans la survie et la persistance des mycobactéries.

  • Association légionelles-amibes et traitements biocides pour les circuits de refroidissement    - Dupuy Mathieu  -  25 novembre 2013

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    Legionella est une bactérie pathogène, ubiquitaire des environnements aqueux. L'utilisation des eaux de surface, par les centrales nucléaires, provoque un réchauffement de ces eaux, qui associé aux conditions de fonctionnement peut entraîner sa prolifération. Afin de limiter le développement de cette bactérie, en deçà des seuils réglementaires, EDF met en œuvre un traitement à la monochloramine dans ses circuits. Notre étude a eu pour but d’améliorer les connaissances sur les associations entre les légionelles et leur principal hôte : les amibes, et sur les facteurs susceptibles d’influencer leur sensibilité au traitement biocide. Nous avons, tout d’abord, mis en évidence la permissivité de 12 souches d’amibes à 2 souches de L. pneumophila. La température est apparue comme le paramètre le plus influant, la prolifération de Legionella semble favorisée à 40°C. Puis, nous avons cherché à développer un protocole pour séparer Legionella selon son état d’association. Ce protocole n’est pas abouti à l’heure actuelle. Finalement, nous avons comparé la sensibilité, de Legionella, dans différents états physiologiques et étudié l’impact de la qualité de l’eau et des MES. Les cellules post-amibes et dans une moindre mesure, les cellules en phases stationnaires sont les moins sensibles. L’effet de la matrice a été mis en évidence pour l’eau de Vienne, par contre la sensibilité n’a pas été modifiée suite à l’élimination ou l’enrichissement en MES. Cette étude constitue une base de connaissances nouvelles pour orienter les choix de gestion du traitement anti-Legionella à la monochloramine et d’exploitation des circuits.

  • Études moléculaire et cellulaire des mutations du gène CFTR : de la génétique à la fonctionnalité de la protéine    - El-Seedy Ayman-Salah-Ahmed  -  17 février 2011

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    La mucoviscidose est la maladie génétique grave à transmission autosomique récessive la plus fréquente dans les populations d'origine européenne. Cette pathologie est due au dysfonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), canal chlorure présent à la membrane apicale des cellules épithéliales. La gravité de la pathologie dépend de la ou des mutations du gène CFTR. L'objectif de nos travaux est de comprendre l'impact des mutations du gène CFTR afin d'établir un conseil génétique avisé. Pour cela, nous avons dans un premier temps déterminé quelles sont les mutations présentes sur l'exon 9 du gène. A cause de la présence de copies de cette région, nous avons établi de nouvelles conditions expérimentales pour étudier exclusivement le gène, et ainsi deux pseudomutations ont été détectées. Dans un second temps, nous avons étudié trois allèles complexes contenant des mutations fréquentes de CFTR (D443Y, G576A, R668C) et une mutation rare, G149R. In vitro nous avons mis en évidence l'effet délétère de G149R seule ou en complexe, et la diminution de la quantité de la protéine mature lorsque les autres allèles complexes sont présents. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons mis en place au laboratoire les techniques d'étude de l'épissage. Pour cela, nous avons construit un minigène hybride qui nous permet de définir le rôle exact des substitutions nucléotidiques sur l'épissage alternatif. Les résultats obtenus à partir de ces trois études nous ont permis de mieux comprendre l'impact des mutations étudiées et ainsi d'émettre un diagnostic moléculaire documenté.

  • Étude de la survie des légionelles et de la dynamique des populations microbiennes des réseaux d'eau chaude : rôle des procédés de décontamination    - Farhat Maha  -  21 octobre 2009

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    Legionella est la bactérie à Gram négatif identifiée dans les épidémies de légionellose liées à la contamination des réseaux d'eau chaude et des tours aéroréfrigérantes. En France, où la maladie est soumise à déclaration obligatoire depuis 1987, plus un millier de cas sont recensés par an parmi lesquels 10 % s'avèrent mortels. Associée à un consortium des cellules microbiennes, Legionella se trouve attachée aux surfaces dans une matrice de polymères organiques et minéraux appelée biofilm. Dans cette structure, elle devient plus résistante aux procédés de désinfection que lorsqu'elle est sous forme libre. C'est dans ce contexte qu'ont été définis les objectifs de ce travail qui s'est articulé autour trois volets principaux : (1) le développement d'un outil analytique permettant l'étude de la dynamique des populations microbiennes dans l'eau et dans le biofilm d'un réseau d'eau chaude après différents traitements anti-Legionella, (2) le suivi de l'évolution de la flore totale procaryote et de Legionella en particulier dans l'eau et le biofilm après un traitement par choc thermique (70 °C pendant 30 minutes) et par un traitement chimique (biocide combiné à un biodispersant) et (3) la caractérisation de la diversité de Legionella dans le biofilm en relation avec la dynamique de la structure microbienne (bactérie et eucaryotes) du biofilm après ces deux traitements. Un pilote à l'échelle 1 constitué de deux boucles d'eau chaude similaires (boucles témoin et test) a été développé et contaminé par un biofilm naturel de Legionella. Les deux traitements testés (thermique et chimique) ont eu un effet transitoire. Un retour aux concentrations initiales en Legionella cultivables dans l'eau et dans le biofilm a été observé une semaine après l'application des traitements. Pour une des premières fois dans ce type d'études, l'utilisation de méthodes moléculaires de pointe (séquençage, SSCP) ont permis d'identifier la diversité de Legionella (cinq espèces dont quatre sont des pathogènes opportunistes) dans le biofilm des réseaux d'eau chaude et de caractériser la flore microbienne qui accompagne Legionella dans cette matrice (protéobactéries, amibes, flagellés, champignons, alvéolates). Ce travail apporte ainsi des éléments novateurs en termes d'outils permettant de tester les traitements anti- Legionella, de méthodes analytiques et de connaissance sur le consortium microbien qui accompagne Legionella dans le biofilm.

  • Multiples conséquences physiopathologiques de mutations et d'allèles complexes du gène CFTR : l'importance des études génétique, moléculaire, cellulaire & in silico dans la détermination de l'impact de ces variations sur l'épissage et la protéine    - Farhat Raëd  -  03 juillet 2014

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    La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies rares chez la population caucasienne. Cette maladie héréditaire récessive est causée par des mutations du gène Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) qui code pour une protéine localisée au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. La sévérité du phénotype est déterminée par les classes des mutations et leurs combinaisons en trans, ainsi que par la présence d'allèles complexes. La détermination des effets d'une mutation est essentielle pour avoir une corrélation génotype/phénotype correcte, donner un diagnostic prénatal adapté et permettre aux cliniciens de prescrire le traitement approprié à chaque mutation quand celui-ci sera disponible. Pour cela, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations qui intéressent le laboratoire : c.1392G>T (p.Lys464Asn), c.3909C>G (p.Asn1303Lys) et c.965T>C (p.Val322Ala). L'effet de ces mutations sur la protéine a été évalué. De plus, l'impact sur l'épissage aberrant des deux premières mutations, seules et dans le cadre de leurs allèles complexes, a été déterminé. Nous avons montré que : 1) la mutation c.1392G>T est de classe V et II et son allèle complexe aggrave l'épissage aberrant, 2) la mutation c.3909C>G appartient à la classe II et l'effet sur l'épissage résulte de son allèle complexe et 3) la mutation familiale c.965T>C est un simple polymorphisme. Ces travaux montrent l'importance de l'étude d'une mutation à différents niveaux cellulaires par l'intermédiaire des analyses in silico, in cellulo et in vivo et soulignent l'effet des allèles complexes qui peuvent moduler l'impact de la mutation seule.

  • Les processus de différenciation et la résistance des kystes aux traitements de désinfection chez l'amibe libre Vermamoeba vermiformis    - Fouque Emilie  -  09 décembre 2013

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    V. vermiformis est une amibe libre répandue dans l'environnement et les milieux artificiels comme les réseaux d'eau chaude sanitaire (RECS). Il est maintenant bien établi qu'elle joue un rôle de réservoir pour des bactéries pathogènes, comme L. pneumophila. Le contrôle de V. vermiformis dans les RECS représente donc un enjeu sanitaire important. Les amibes libres peuvent passer d'une forme métaboliquement active (trophozoïte) à une forme de résistance, le kyste, lorsque les conditions sont défavorables ce qui leur confère une résistance aux traitements. Malgré la haute prévalence de V. vermiformis dans les RECS, les processus de différenciation et la résistance de ses kystes aux traitements n'ont été que peu étudiés. Nous avons donc investigué les changements morphologiques et ultrastructuraux qui s'opèrent lors de l'enkystement et désenkystement de V. vermiformis. Il en ressort que l'enkystement est un phénomène rapide (9 h) qui conduit à la formation de kystes entourés d'une paroi double couche. Lors du désenkystement, les trophozoïtes n'émergent pas à travers un ostiole comme c'est le cas chez Acanthamoeba. Puis, nous avons étudié l'effet des conditions environnementales et de la concentration cellulaire sur l'enkystement. Nous avons observé que plus la concentration cellulaire est élevée plus l'enkystement est rapide, ce qui suggère l'existence de mécanismes de communication intercellulaire. Enfin, nous avons étudié la résistance des kystes aux traitements utilisés dans les RECS et aux protéases. Ces traitements étaient efficaces, in vitro, pour inactiver les kystes de V. vermiformis. Ces travaux ont permis d'apporter des connaissances de bases sur les processus de d

  • Impact des facteurs environnementaux sur l'état physiologique et l'infectiosité de Legionella pneumophila Lens    - Koubar Mohamad  -  15 juin 2011

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    Nous avons étudié l'impact des différents facteurs environnementaux tel que la présence de matières minérales ou organiques sur le comportement de L. pneumophila dans le milieu hydrique. Nous n'avons pas observé d'influence importante de la présence des matières minérales ou organiques sur la survie des légionelles dans l'eau. Cependant, la présence de matières minérales, notamment le calcium, favorise l'adhérence de L. pneumophila aux surfaces. Nous observons que le maintien de la bactérie dans une solution de chlorure de calcium, par rapport à de l'eau distillée, provoque des modifications du profil protéique. Nous avons également étudié l'impact du passage de Legionella à travers Tetrahymena tropicalis, un cilié d'eau douce isolé dans les mêmes niches écologiques de Legionella. Le travail réalisé montre que les légionelles post-Tetrahymena deviennent plus résistantes à différentes conditions de stress (antibiotiques, carence nutritionelle) et plus infectieuses pour les pneumocytes humains par rapport à des légionelles cultivées en phase stationnaire. L'impact important que semble jouer ces protozoaires sur le risque légionelle devrait donc être pris en compte et la relation légionelles-Tétrahymena être étudiée de façon plus intensive. Nous avons également évalué l'infectiosité de différents phénotypes de L. pneumophila sur cellules humaines (macraphages, pneumocytes) et sur modèle murin (souris A/J, expérimentations réalisées dans l'Unité INSERM U151 sous la direction du Dr Florence Ader), en utilisant des bactéries ayant séjournées dans l'eau distillée ou dans l'eau minérale et des bactéries post-amibies, répliquées dans l'amibe Acanthamoeba castellanii...

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